丝素蛋白水凝胶支架的制备及其性能

李艾元，施心雨，岳万福，游卫云

(浙江农林大学 动物科技学院·动物医学院，浙江 杭州 311300)

20世纪70年代，支架工程已成为组织工程领域研究的热点[1],支架工程的核心是模拟天然的细胞外基质[2]。基于生物学、工程学、医学等原理设计出的组织工程支架可以适应不同组织的生物结构要求[2]。将组织工程与三维细胞培养、静电纺丝等技术相结合，使得支架材料可以满足：作为细胞的外基质使细胞增殖、分化[3-4]；不会与宿主发生免疫排斥反应[5]；人为控制降解速度，以满足新组织的生长要求[6]；为细胞提供机械支撑，确保在植入前期给支架中的细胞提供必要的结构支持[7]；具有可控的处理体系[8]，面对不同的组织能够提供可变的结构支撑。研发组织工程支架的目的是使受损组织可修复或者新生[9-10]。

与人工合成材料相比，丝素蛋白具有优异的力学性能和生物相容性，可适应不同组织的生长速度，在支架工程领域焕发新的光芒[11]。丝素蛋白有3种结构蛋白，包括丝素重链(2 390 ku)、轻链(226 ku) 和小糖蛋白P25(30 ku)[12]。丝素蛋白的重链具有两亲性，包含疏水块和亲水块，其中疏水块对丝素蛋白β折叠起重要作用[13]。然而与疏水区域相比，亲水区域是一个较短且不重复的片段[14]，因此，丝素蛋白不能溶于水，但可被潜在的反应侧基修饰，如醇、酚、胺、羧基等[15]。这种改性可引起丝素蛋白亲水性和孔隙度的变化，实现可控的丝素蛋白支架制备[16]。为此，本文拟采用二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)来诱导脱胶丝素蛋白(SF)形成水凝胶，研究了不同浓度DMPG对支架材料的生物相容性、SF水凝胶支架凝结速度等的影响。

1 实验部分

1.1 材料和仪器

材料：蚕丝，工业级，杭州林然生物科技公司；DMPG，分析纯，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；F12培养基、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、二甲基亚砜(DMSO)、双抗、IV型胶原酶、CCK-8试剂盒、细胞筛，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；磷酸缓冲溶液(PBS)、溴化锂(LiBr)、碳酸氢钠、75%乙醇，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；山羊血清、马血清、4%多聚甲醛、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)，杭州昊鑫生物科技股份有限公司；透析袋MD34，上海索桥生物科技有限公司；HE染色试剂盒，杭州浩克生物科技有限公司；中性树胶，国药集团化学剂有限公司。

仪器：TI-S荧光倒置显微镜，日本尼康公司；synergyH1多功能酶标仪、SU8010扫描电子显微镜，日本松下集团；RM2255全自动轮转切片机，德国菜卡公司；BJYSL-DHG-9023A恒温烘箱，苏州华洁烘箱制造有限公司；HF90二氧化碳培养箱，力新仪器(上海)有限公司；Sorvall LYNX 6000离心机，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2 样品制备及性能表征

蚕丝的结晶度较高，普通的手段无法使其降解，且因其中含有的丝胶蛋白会引起免疫反应，因此，不能直接用于制备组织工程支架，需先溶解蚕丝纤维得到丝素水溶液[17-18]。

1.2.1 蚕丝脱胶

参照文献[19]的方法将蚕丝剪成2 cm长度，按照1∶200的浴比加入至0.5%的碳酸氢钠溶液中煮沸30 min，期间每隔15 min用玻璃棒翻1次；然后依次用去离子水洗脱3次，清洗6次，最后将脱胶的蚕丝放入烘箱，温度设置为37 ℃，干燥12 h后得到丝素蛋白。

1.2.2 脱胶前后蚕丝形貌观察

将脱胶前后的蚕丝分别用导电胶贴在工作台，喷金处理 60 s。采用背散射模式、标准束流，通过扫描电子显微镜观察样品形貌，加速电压为 10 kV。然后将样品的扫描电镜照片导入 Nano Measurer 1.2软件中，进行直径测量。

1.2.3 丝素蛋白的溶解

首先，用600 mL超纯水溶解807.7 g无水溴化锂(LiBr),然后用磁力搅拌器搅拌24 h，完全冷却后加入超纯水至1 000 mL，最后使用真空抽滤机抽滤至澄清，得到浓度为 9.3 mol/L的LiBr溶液。将制得的 LiBr 溶液放入60 ℃的烘箱中预热 30 min，然后将丝素蛋白按照1∶4的溶质比溶解在9.3 mol/L LiBr溶液中，放入 60 ℃烘箱中溶解2 h，期间每隔15 min 取出搅拌1次，制得丝素蛋白LiBr溶液。将制得的丝素LiBr溶液在透析袋(分子量3 200)中透析3 d，除去丝素LiBr溶液中的LiBr，然后用纱布过滤后，在低温高速离心机上以7 000 r/min离心 20 min，保留上清液，用0.22 μm针头滤器过滤上清液后，放入4 ℃冰箱备用。

1.2.4 丝素蛋白水凝胶的制备

首先，分别用去离子水配制5、10、15 mmol/L的DMPG溶液；然后，将丝素蛋白溶液、DMPG溶液振荡混合均匀，其中丝素蛋白溶液质量分数为4%；最后将共混溶液在25 ℃下培养形成水凝胶。

1.2.5 凝胶时间的测定

使用离心管倾斜法测定凝胶时间。将溶液按照不同的配比装入1.5 mL的离心管中混合均匀。将离心管在25 ℃下培养，每隔30 s 倾斜1次，每次倾斜大概45°，若10 s内管内液体没有沿管壁流动则凝胶成功，计算开始至凝胶成功的时间，取3次实验的平均值记为凝胶时间。

1.2.6 种子细胞的获取与培养

采用胶原酶消化法分离湖羊骨骼肌卫星细胞，具体操作步骤为：1)在无菌条件下剥离湖羊胎儿后肢腿部肌肉组织，然后用75%乙醇轻微浸泡消毒后立即用PBS冲洗2次，放入盛有PBS的35 mm 细胞培养皿中；2)利用眼科剪将肌肉组织剪碎，加入适量Ⅳ型胶原酶后放入37 ℃、5% CO2培养箱中消化15 min，每隔5 min取出吹打1次，共3次；3)消化结束后，加入2倍体积的DMEM/F12A培养基(DMEM/F12培养基+10%FBS) 终止消化，用细胞筛过滤并收集细胞悬液至15 mL 离心管中，用低速离心机(1 200 r/min)离心15 min，弃上清液；4)加入DMEM/F12B培养基(DMEM/F12培养基+10%FBS+ 1%双抗)重悬细胞，将细胞悬液接种至100 mm细胞培养皿中，放入37 ℃、5%CO2培养箱中进行培养，得到的细胞为丝素水凝胶支架种子细胞，后续用于与支架一同注射入湖羊体内。待细胞汇合度达到70%～80%时，可将其作为种子细胞植入到水凝胶中。

1.2.7 SF水凝胶支架生物相容性的测定

将种子细胞培养至对数期，参考文献[18]方法测定DMPG浓度对SF水凝胶生物相容性的影响如见表1所示。具体步骤为：1)在无菌超净台上用75%乙醇浸洗SF水凝胶支架6 min，其次用PBS 反复浸洗5次，每次3 min，浸洗完成后加入F12培养基(不含胎牛血清)浸过水凝胶，在培养箱 (37 ℃、5%CO2) 中静置24 h 后即可制得SF水凝胶浸提液；2)把生长至对数期的种子细胞接种在96 孔板中，在培养箱中(37 ℃、5%CO2)预培养24 h ，更换细胞培养液，然后加入10 μL预先制备好的SF支架浸提液，不加浸提液的为空白组；3)将96孔板在细胞培养箱中培养12～48 h，取出种子细胞96孔板，向其中的每个孔中加入110 μL CCK-8 工作液，将96孔板在细胞培养箱中孵育30 min 后取出，最后使用酶标仪在450 nm 波长条件下测定各孔吸光度平均值，并通过对照组评定水凝胶的生物相容性(R)。

表1 细胞活力与生物相容性关系Tab.1 Relationship between cell proliferation rate and biocompatibility

式中：A、B、C分别为实验组、空白组和对照组的吸光度。

1.2.8 体内肌肉再生实验

首先，用去离子水配制10 mmol/L的DMPG水溶液，放入4 ℃冰箱备用。将生长至对数生长期的种子细胞制成细胞悬液，放入离心管中备用。将丝素蛋白溶液、DMPG溶液、种子细胞悬液混合均匀，使得丝素蛋白溶液质量分数为4%，DMPG的浓度为10 mmol/L，种子细胞的密度为1×105个/mL，振荡混合均匀后将共混溶液在25 ℃下培养3 min。

将要注射水凝胶的湖羊分为4组，分别是含种子细胞水凝胶组、不含种子细胞水凝胶组、单纯种子细胞组和单纯丝素蛋白溶液组；每组6只2月龄湖羊，公母各半，每只湖羊注射0.5 mL，做好标记后归栏饲养，正常饮食。

1.2.9 样品的HE染色

将湖羊注射部位的皮肤层连同耳部肌肉层一同剪下，此时的水凝胶层在皮肤层和肌肉层之间，将取得的湖羊耳部样品固定于4%多聚甲醛24 h以上。然后按照HE染色试剂盒的步骤进行染色，将染色结果置于显微镜下观察，进行图像采集分析。

1.3 数据处理

本文所有统计结果使用SPSS22.0软件，并采用方差进行单向分析(单向 ANOVA 测试)。差异结果使用P<0.05(*)、P<0.01(**)表示。

2 结果和讨论

2.1 蚕丝脱胶分析

弱碱法(碳酸氢钠)[20]处理的蚕丝，原理是利用丝胶蛋白和丝素蛋白溶解度的不同，除去蚕丝中的丝胶蛋白。蚕丝脱胶前后扫描电镜照片如图1所示。可以看出：未脱胶蚕丝(见图1(a))本身整体呈圆柱形，表面光滑，直径为7.67～11.4 μm；脱胶处理(见图1(b))后，蚕丝的直径为6.36～11.7 μm。脱胶前的蚕丝粗细差别较小，表面规整光滑，脱胶后蚕丝由于失去了丝胶蛋白，蚕丝粗细差别增加，表面粗糙扁平。根据文献[21]报道，丝胶蛋白的存在会导致免疫原性，通过脱去丝胶蛋白制成的支架没有免疫原性，因此，除去丝胶蛋白是实验进行的重要前提。

图1 脱胶前后蚕丝的SEM照片(×1 000)Fig.1 SEM images of silk before(a)and after(b)degumming(×1 000)

2.2 水凝胶支架凝结时间分析

DMPG浓度对SF水凝胶凝结时间的影响结果如图2所示。可以看出，随着DMPG浓度的增加，SF的凝胶时间逐渐变短，凝胶速率逐渐加快。在3个浓度的实验中，DMPG浓度为15 mmoL/L时可使凝胶时间缩短至10 min，这是因为随着DMPG浓度的提高，DMPG中的磷脂和SF链之间发生静电和疏水作用，导致SF链由无序的α螺旋向β折叠结构转变，且该转变是一个不可逆过程，因此，SF凝胶快速形成。综上分析可知，可通过改变DMPG浓度来控制凝胶时间。

图2 DMPG浓度对SF水凝胶凝胶时间的影响Fig.2 Effect of DMPG concentration on SF gel of gel time

2.3 水凝胶体外生物相容性分析

图3示出不同DMPG浓度的水凝胶支架浸出液对种子细胞活力的影响。可以看出：DMPG浓度为10 mmol/L时，制备的水凝胶生物相容性最好；当DMPG浓度为15 mmol/L时虽然凝胶速度最快，但其生物相容性最差。所有加入浸提液的实验组与空白组相比，细胞活力没有降低，说明该水凝胶支架没有细胞毒性，DMPG处理过的实验组具有优异的生物相容性和生物安全性，同时对细胞增殖有促进作用。

图3 不同浓度DMPG水凝胶支架的细胞活力Fig.3 Cytotoxicity of hydrogel scaffolds with DMPG different molar concentrations

2.4 水凝胶体内生物相容性分析

图4示出不同天数样品水凝胶层的HE染色结果。可以看出：在水凝胶植入24 h后，在SF水凝胶的保护下，其中的种子细胞(见图4(a) 中黑色圆圈部分)开始增殖分化，通过水凝胶介质与湖羊进行营养物质交换、气体交换和新陈代谢废物的排出；随着植入天数的增加，水凝胶中的种子细胞(见图4(b) 中黑色圆圈部分)退出增殖周期，水凝胶中的细胞分化为肌肉组织，直到水凝胶中的细胞(见图4(c) 中黑色圆圈部分)完全分化为肌肉组织。图4(c) 与图4(b)相比，水凝胶中的肌原纤维进一步生长，具体表现为长度的延伸，这是因为水凝胶可召集体内的成肌细胞继续增殖分化，直至水凝胶中的肌肉组织(见图4(c)中黑色圆圈部分)与正常的肌肉组织HE染色(见图4(c)中白色圆圈部分)差异逐渐消失。从以上结果可以得出：DMPG诱导的SF水凝胶成功地模拟了天然细胞外基质，且没有引起湖羊的免疫排斥。结合图5展示的结果进一步分析表明，水凝胶成功在湖羊皮肤层和肌肉层的空隙中凝结，形成了一层水凝胶，单一加入丝素蛋白或者细胞悬浮液均不会对湖羊产生任何影响。综上得出，DMPG诱导的SF水凝胶必须加入种子细胞才可以进行组织再生和修复，否则支架会在体内进行降解，而不会有新的组织生成。

图4 不同天数样品水凝胶层HE染色结果(×200)Fig.4 HE staining results of hydrogel layers for samples of different days(×200)

图5 不同天数水凝胶层的宽度Fig.5 Width of hydrogel layers in different days

2.5 水凝胶支架降解分析

图6示出植入湖羊耳部水凝胶降解的HE染色图片。由图6(a)可看出，水凝胶包裹的肌肉细胞进行增殖分化，水凝胶表面逐渐开始降解，形成大小不一的孔隙，肌肉细胞通过这些孔隙可和湖羊进行物质交换(见图6(b))，保证充足的供给，当肌肉生长到一定程度后，已经能够自发地从湖羊耳部获取营养物质(见图6(c))，便不再需要SF水凝胶支架的存在。由于种子细胞来自湖羊，而且SF水凝胶支架本身不会引起免疫反应，因此，才可以成功地长出新生肌肉。通过上面的结果不难看出：DMPG诱导的SF水凝胶支架是一种绿色可降解的组织工程支架。

图6 不同天数水凝胶支架HE染色结果Fig.6 HE staining results of hydrogel scaffolds in different days

3 结 论

本文制备了一种可控的、无免疫原性的丝素(SF)蛋白水凝胶，通过改变SF溶液中二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)的浓度，探讨并分析其对水凝胶凝胶时间、生物相容性和免疫原性的影响，得出如下主要结论：1)弱碱法可以去除丝胶蛋白，脱胶前后蚕丝直径变化约为 0.3 μm；2)DMPG加速了SF水凝胶的快速形成，只需要10 min就可使SF成功凝胶；3)水凝胶注射后最终在湖羊耳部皮下和软骨之间形成0.5 cm的水凝胶-肌肉复合体；4)DMPG诱导的SF水凝胶具有优异的生物相容性，是一种绿色可降解，无免疫原性的组织工程支架。

FZXB