镉胁迫对延胡索生理及生物碱积累的影响

展晓日，吴琦聪，黄洁芳，沈晨佳，王慧中

(杭州师范大学生命与环境科学学院 浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室，浙江 杭州 310036)

延胡索(Corydalisyanhusuo)别称元胡、玄胡索、玄胡，为罂粟科紫堇属多年生草本植物，广泛分布于我国江南丘陵地带。延胡索是传统道地药材“浙八味”之一，以地下块茎入药，具有活血、化瘀、止痛等作用[1]。浙江东北部平原丘陵地带包括嘉兴、绍兴和金华地区是延胡索的主产区，延胡索也是当地药农的收入的重要来源[2-3]。现代药学研究表明，延胡索制剂对于治疗冠心病、胃肠溃疡及多种肿瘤疾病具有良好药效。而延胡索中的主要活性成分为多种特有的生物碱，如原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、延胡索乙素等[4]。因此，生物碱含量是延胡索质量的重要指标。

随着经济的快速发展，大量工业废水进入农田水域，造成土壤重金属严重超标。重金属镉(Cd)被作物吸收富集，通过食物链进入人体，可引起慢性中毒[5]。由此可见，重金属Cd超标对生态环境及人体健康造成很大影响[6]。针对延胡索重金属胁迫的研究已有部分报道。余顺慧等[7]研究表明，铬污染对延胡索生长和生理特性有显著影响。李云跃等[8]发现，重金属铅对延胡索生长及不同器官生物量的积累有显著的抑制作用。但重金属Cd胁迫对延胡索的生长及生物碱产量的影响还尚且未知。本研究以延胡索为研究对象，设置不同浓度Cd处理，测定延胡索在Cd胁迫下的生理指标和生物碱积累情况。本研究的结果对理解延胡索对重金属Cd胁迫的响应机制，优化延胡索的栽培条件提供了实践经验和理论指导，具有较高的应用价值。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验植物材料延胡索(Corydalisyanhusuo)栽培于杭州师范大学仓前校区种植基地。

1.2 处理设计

试验材料为延胡索块茎，筛选大小一致的块茎100块左右，种植于独立花盆(直径30 cm)中，每盆装土壤10 kg，进行常规土肥管理。

本试验采用1个对照组和3个处理组，每组3个平行重复。开展Cd单一环境因子胁迫试验，处理组以CdCl2作为Cd2+来源。将栽培的延胡索幼苗取出后进行水培，营养液中的Cd2+浓度分别为0，100，200，300 μmol·L-1。镉胁迫处理6 d后，收集延胡索幼苗叶片至1.5 mL离心管，用液氮冷冻后，移至-80 ℃超低温冰箱保存。

1.3 延胡索叶绿素、可溶性蛋白等含量测定

叶绿素含量采用紫外分光光度法测定。每组试验操作都进行3个生物学重复。鲜叶片剪成细丝状后准确称取0.2 g，放入加有25 mL丙酮-乙醇混合提取液(体积比为1∶1)的试管中，封口后将试管置于暗处直至叶片颜色完全变白。使用DU-800紫外/可见光分光光度计分别在663、646和470 nm下测定浸提液的吸光值。

可溶性糖含量测定采用蒽酮法[9]。将样品从-80 ℃冰箱中取出，称取250 mg，加入10 mL去离子水，煮沸30 min，定容于25 mL。显色反应吸取0.5 mL样本溶液，加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5 mL浓硫酸，充分振荡后置于沸水浴中煮沸，冷却后，在630 nm波长下测定其吸光度。

脯氨酸含量使用酸性茚三酮法测定。称取不同试验组的延胡索叶片各500 mg，加入3%磺基水杨酸5 mL，沸水浴10 min后，加入2 mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮试剂，沸水浴30 min，冷却后加入4 mL甲苯终止反应，在520 nm波长处测定吸光值。

1.4 延胡索丙二醛(MDA)含量测定

MDA采用硫代巴比妥酸法测定[10]。称取延胡索叶片样本1 g，加入10 mL的10% TCA缓冲液，研磨成匀浆，离心后得上清液。吸取2 mL上清液，以去离子水为空白对照，加入2 mL 0.6%的TBA缓冲液，沸水浴15 min，冷却后离心取上清液，测定532 nm、600 nm和450 nm波长下的吸光度。

1.5 延胡索3种酶活性测定

使用武汉赛培生物科技有限公司试剂盒测定过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和过氧化物酶(CAT、SOD和POD)活性，试验方法参见产品说明书。

1.6 延胡索不同生物碱含量测定

分别精确称量原阿片碱(5.24 mg)、小蘖碱(5.16 mg)、延胡索乙素(4.60 mg)和脱氢紫堇碱(5.06 mg)标准品，定容于10 mL容量瓶中，得到对照品母液，依次逐级稀释。将延胡索块茎取样，粉碎之后精确称取0.5 g，加入氨水-甲醇(1∶20)混合液50 mL，冷浸1 h，热回流1 h，冷却后吸取滤液25 mL，蒸干后，用甲醇溶解所得固体物，定容后备用。

色谱柱为Agilent 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，三乙胺pH调为6.0；梯度洗脱程序为0∶100(0 min)→20∶80(15 min)→80∶20(35 min)，流速为1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长为280 nm。

1.7 数据统计学分析

采用Excel软件进行试验数据处理，使用SPSS 22.0分析软件进行方差分析，P<0.05表示样本间差异显著。

2 结果与分析

2.1 重金属镉胁迫对延胡索总叶绿素含量的影响

叶绿素是植物生长发育的必需色素，是光合作用得以顺利进行的基础条件，直接关系到光合作用的水平。使用0、100、200、300 μmol·L-1的镉溶液，处理延胡索幼苗6 d，测定总叶绿素含量的变化。结果表明，对照组的延胡索总叶绿素含量为1.54 mg·g-1，6 d之后叶绿素含量基本保持不变；处理组叶绿素含量有着显著下降，在100 μmol·L-1镉胁迫下叶绿素含量下降为1.30 mg·g-1，在200 μmol·L-1镉胁迫下叶绿素含量下降为1.11 mg·g-1，在300 μmol·L-1镉胁迫下叶绿素含量下降为1.23 mg·g-1(图1)。

*表示处理与对照间差异显著(P<0.05)，图2～4同。

2.2 重金属镉胁迫对延胡索脯氨酸含量的影响

近年来的研究表明，重金属胁迫会导致植物体内脯氨酸的大量积累，以提高植株对重金属胁迫的抗性和适应性。使用0、100、200、300 μmol·L-1的镉溶液，处理延胡索幼苗6 d，测定脯氨酸含量的变化。结果表明，对照组的延胡索脯氨酸含量为235.5 μg·g-1，6 d之后脯氨酸含量基本保持不变；处理组脯氨酸含量有着显著上升，在100 μmol·L-1镉胁迫下脯氨酸含量上升为446.1 μg·g-1，在200 μmol·L-1镉胁迫下脯氨酸含量上升为475.1 μg·g-1，在300 μmol·L-1镉胁迫下脯氨酸含量上升为390.5 μg·g-1(图1)。

2.3 重金属镉胁迫对延胡索可溶性蛋白含量的影响

重金属进入植物体后会抑制各类代谢活动，尤其是蛋白质的合成，而可溶性蛋白质含量是重金属胁迫的重要测定指标。图1表明，对照组的延胡索可溶性蛋白含量为1.47 mg·g-1，6 d之后可溶性蛋白含量基本保持不变；处理组可溶性蛋白含量有着显著上升，在100 μmol·L-1镉胁迫下可溶性蛋白含量上升为3.48 mg·g-1，在200 μmol·L-1镉胁迫下可溶性蛋白含量上升为3.11 mg·g-1，在300 mmol·L-1镉胁迫下可溶性蛋白含量上升为2.14 mg·g-1。

2.4 重金属镉胁迫对延胡索MDA含量的影响

MDA是重金属胁迫下，植物生物膜系统受损的重要指标，它反映膜脂过氧化的程度。如图2所示，在对照组中MDA保持较低水平，镉处理显著诱导MDA含量水平(0.093 μmol·g-1)。在镉处理6 d后，MDA含量显著上升，其中在300 μmol·L-1镉胁迫下上升接近十倍(0.951 μmol·g-1)。而镉处理浓度越高，MDA含量积累也更高，表明在高浓度镉胁迫下，植物膜脂系统遭到更为严重的破坏。

图2 重金属镉胁迫对延胡索MDA含量的影响

2.5 重金属镉胁迫对延胡索的抗氧化酶活性的影响

CAT、SOD和POD是植物体内的抗氧化酶系统的重要组成部分，它们三者相互协调配合可以有效地清除植物体内的氧自由基和过氧化物。CAT具有极强的催化能力，将H2O2分解为O2和H2O。镉胁迫导致CAT活性下降，从对照组的211.2 U·g-1，下降大约50%。其中，高浓度镉处理(300 μmol·L-1)导致CAT活性下降最多，从211.2 U·g-1下降到109.2 U·g-1(图3)。SOD是一类超氧化物歧化酶，负责清除植物体内的氧自由基。镉胁迫导致SOD活性显著下降，随着镉处理浓度的升高，SOD活性下降更为明显。在300 μmol·L-1镉处理下，SOD活性从155.0 U·g-1下降为86.4 U·g-1。POD和SOD发挥着同等作用，也是超氧化物歧化酶的一种。镉胁迫导致POD活性显著上升，在对照组下POD的活性仅为535.7 U·g-1，在100 μmol·L-1镉处理下POD活性上升最为显著，达到2 954.8 U·g-1。随着镉处理浓度上升，POD活性上升幅度反而有所下降，在300 μmol·L-1镉处理下POD活性为1 140.9 U·g-1。

图3 重金属镉胁迫对延胡索3种抗氧化酶活性的影响

2.6 重金属镉胁迫对延胡索生物碱含量的影响

延胡索含有一系列生物碱，是其主要的活性成分，重金属污染是否影响延胡索生物碱的含量是被关注的重要问题。本研究中，选择4种延胡索标志性的生物碱类活性成分，探索镉胁迫处理对延胡索生物碱含量的影响。在镉胁迫处理下，4种生物碱活性物质含量均有所下降，其中小蘖碱的下降幅度最为明显。原阿片碱含量在镉胁迫处理下显著下降，但是不同浓度的镉处理对其含量影响不大(图4)。小蘖碱含量在不同浓度镉胁迫处理下并不相同，镉浓度越高，其含量下降越显著。延胡索乙素和脱氢紫堇碱在低浓度镉胁迫下(100和200 μmol·L-1)下降幅度较小，在高浓度镉胁迫处理下，下降幅度达到50%。

图4 重金属镉胁迫对延胡索4种生物碱含量的影响

3 小结与讨论

延胡索是我国重要的中药材之一，也是其主产地药农增收的主要经济作物[11]。延胡索活性成分主要由各类生物碱组成，生物碱的含量是延胡索经济价值的重要指标。然而，延胡索活性成分含量会受到外界环境的影响，进而影响到延胡索的药效。有研究表明，影响延胡索活性成分含量的因素主要与延胡索品种、提取加工工艺、产地和环境因素等有关[12-13]。随着环境污染的加剧，环境因素越来越成为影响延胡索品质的决定性因素。

重金属镉是影响植物类中药材的环境风险因子之一，危害人体健康。生理数据表明，镉胁迫显著降低延胡索中的叶绿素含量，说明其可能通过降低延胡索光合生理特性而影响幼苗的生长发育，这与其他多种植物在镉胁迫下的表现一致，如水稻、夏枯草等[14-15]。此外，低浓度镉胁迫显著提高脯氨酸和可溶性蛋白的含量，说明延胡索是镉敏感性植物。

植物抗氧化酶系统影响植株主要和次生代谢产物的积累[16]。在镉胁迫处理下，3种主要的抗氧化酶指标均表现出显著变化，说明延胡索的次生代谢系统受到镉胁迫的严重破坏。随着镉胁迫浓度的增加，CAT和SOD的活性变化较小，说明CAT和SOD活性对镉浓度不敏感。而低浓度镉处理组的POD活性上升最为显著，达到2 954.8 U·g-1(对照组POD活性为535.7 U·g-1)，但随着镉浓度的上升，POD活性逐渐下降，说明高浓度镉破坏了POD酶分解毒素的系统。镉胁迫处理极大地削弱了抗氧化酶系统对氧自由基的清除能力，导致膜脂过氧化，进而产出过量的MDA，损害膜功能，对细胞有极大的毒害作用。

测定了原阿片碱、小蘖碱、延胡索乙素和脱氢紫堇碱4种延胡索重要的生物碱在镉胁迫下的变化情况，评价重金属镉污染对延胡索品质的影响。原阿片碱在镉胁迫下含量下降，但不同浓度的镉处理对原阿片碱的含量影响不大，说明原阿片碱的生物合成对镉污染的程度不敏感。其中，小蘖碱含量受到镉胁迫的影响最大，从对照组的54.3 μg·g-1降至300 μmol·L-1镉处理下的18.4 μg·g-1，降幅接近70%。结果表明，镉胁迫会影响延胡索主要活性物质的含量，进而影响延胡索药材的品质。

本研究表明，重金属镉处理破坏了延胡索的抗氧化酶系统，影响延胡索次生代谢的进行。原阿片碱、小蘖碱、延胡索乙素和脱氢紫堇碱4种不同生物碱在镉胁迫下含量均显著下降，说明镉胁迫降低了延胡索的质量，对延胡索的品质造成严重损害，延胡索大规模栽培应选择在无镉污染的土壤中进行。