猪肺炎支原体黏附因子P97蛋白研究进展

涂尾龙，吴华莉，黄济，张莺莺，王洪洋，曹建国，卫金良，甘叶青，唐赛勇，谈永松*

(1.上海市农业科学院 畜牧兽医研究所，上海 201106；2.上海种猪工程技术研究中心，上海 201106；3.上海市嘉定区动物疫病预防控制中心，上海 201800)

猪气喘病(EP)是由猪肺炎支原体(Mhp)引起的猪呼吸系统慢性传染疾病[1]，具有高传染性、高致病率、低死亡率的特性，尤其是冬季寒冷季节，猪气喘病发病率高，影响生猪的存活率、生长速度等指标，造成重大的经济损失，影响了养殖企业的经济效益。早在1983年，Geary等[2]研究发现，Mhp细胞质中没有致病因子，更深一步研究发现了Mhp致病的主要因素是细胞膜蛋白。张映等[3]于2002年研究猪肺炎霉形体及其膜致细胞病变，发现猪肺炎支原体的细胞膜对兔的肾细胞具有一定的毒性，更加证实了这种细胞膜蛋白的存在。Zhang等[4]研究发现，猪肺炎支原体致病因子黏附因子就是P97蛋白，其位于Mhp膜的表面，能够特异地结合到猪呼吸道黏膜的纤毛上，引起猪气喘病发作，在猪肺炎支原体致病中起关键作用。所以，本文从P97蛋白的分子结构、免疫原性、单抗制备和疫苗等方面进行阐述，为针对P97蛋白研制基因工程疫苗提供参考。

1 P97蛋白的分子结构

Tajima等[5]研究发现，利用超薄切片技术和电子显微镜观察，Mhp荚膜为20 nm，能够使得支原体黏附在纤毛的表面，从而造成了纤毛的脱落。Zhang等[6]最早利用单克隆抗体鉴定出黏附因子P97蛋白，其位于Mhp膜的表面，能够黏附于呼吸道黏膜的纤毛上。1997年，Hsu等[7]经过对P97基因进行测序，发现P97编码一个大小为124.9 ku的蛋白，然后其蛋白水解加工成为102.9 ku大小的蛋白，最后在聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上显示大小为97 ku的蛋白。1998年，Hsu等[8]继续对Mhp国际标准株232株的黏附因子P97基因克隆分析，发现P97主要功能区存在于C末端，包括含有15个重复基元(AAKPV/E)的R1区和4个重复基元(GTPNQGKKAE)的R2区。Minion等[9]利用免疫印迹技术对P97蛋白和纤毛结合的研究中发现，至少有8个P97蛋白R1区重复基元才能和纤毛结合，抗体识别需要至少3个重复基元。其中，P97蛋白的主要抗原决定簇区是在R1区，进一步发现了Mhp的黏附能力和致病力与R1、R2重复基元数量有十分密切的相关性[10-11]。王凯等[12]在构建猪肺炎支原体P97基因重组腺病毒时发现，P97基因由3 339个核苷酸组成，共编码1 113个氨基酸。

2 P97蛋白的免疫原性

2003年，Shimoji等[13]利用P97 C末端构建了ErysipelothrixrhusiopathiaeYS-19菌株，然后滴鼻免疫仔猪，发现仔猪肺病变数量显著减少，但在仔猪血清中没有发现P97特异性抗体。这可能是因为单一抗原并不能有好的免疫原性，不能很好地保护仔猪免疫力，需要更多的抗原或者重组蛋白抗原诱导机体产生特异性抗体，需要进一步深入地对P97进行研究。2006年，Chen等[14]构建了重组的小鼠沙门氏菌Aroa CS332株疫苗，其携带了P97 R1，然后通过口服接种免疫，小鼠脾细胞能检测到显著的γ-干扰素，说明诱导了细胞介导的免疫反应。Ogawa等[15]对前者实验进一步改良，通过皮下注射接种SC和口服Koganei株两种方式免疫仔猪，效果非常显著，能很好地保护仔猪，产生了特异性的IgA和IgG，也降低了仔猪肺部病变。2010年，Okamba等[16]利用P97重组缺陷腺病毒疫苗rAdP97c免疫仔猪，成功诱导出了两种非常重要的P97特异性体液免疫和细胞免疫应答。2009年，陈超等[17]利用GenBank中的232株，扩增P97蛋白的C末端并得到了一个670 bp片段，然后克隆到pShttle-CMV载体上，构建了重组腺病毒质粒，经过Pac I酶切后转染到AD293细胞，最后将纯化的重组病毒通过肌注和滴鼻的方式接种小鼠，获得特异性IgG，产生特异性的体液免疫和黏膜免疫，但不产生细胞免疫应答。2010年，卢会英等[18]通过将Mhp纤毛黏附区R1和大肠埃希氏菌中不耐热肠毒素B亚单位(具有黏膜免疫佐剂功能)进行基因重组表达，构建了pET28a(+)-rLTBR1和pET28a(+)-rR1这两个原核表达质粒，诱导表达得到了两个融合蛋白rLTBR1和rR1。2015年，王凯[19]采用了PCR技术扩增Mhp毒株659的黏附因子P97，并对其进行测序，然后将其克隆在质粒pacAd5CMVK-NpA上，构建了其基因重组的腺病毒，结果发现，虽然重组P97蛋白Ad-P97不能在PK15细胞中增殖并引起细胞病变，但可以在Ad-P97蛋白上感染的AD-293细胞和PK15细胞中高效表达，说明重组蛋白Ad-P97具有良好的免疫原性，可以抑制Mhp对PK15细胞的黏附功能，可进一步诱导仔猪免疫基因组疫苗后产生Mhp凝集抗体。2020年，徐嫚[20]运用相关信息软件技术，在Mhp183基因上筛选出一段大小为195 bp的核苷酸序列，将3段Mhp183195bp克隆到pET100载体上，在大肠埃希氏菌上进行表达，结果表明，成功得到30 ku蛋白，该蛋白对His-Tag鼠单抗和Mhp特异性血清都能产生特异性反应，具有良好的免疫原性。以上都说明，P97蛋白具有非常好的免疫原性，是研究Mhp基因重组疫苗的突破口和关键所在。另外，P97蛋白引起的免疫应答反应，能比其他抗原蛋白引起的免疫应答反应提前很长时间被检测到，这对预防生猪EP有重大的防控意义。

3 P97蛋白的疫苗相关研究

目前，国内外Mhp疫苗已有上市，主要有4种：灭活苗、弱毒苗、基因工程苗和联合疫苗。其中，灭活苗占据市场为主，基因工程苗和联合疫苗大部分仍在研究阶段。目前市场上有20多种灭活苗[21]，主要有PHARMGATE生产的Myco Gard和Myco Gard1、ELANCO生产的Myco shield和Stellamune Once、勃林格生产的茵格发、硕腾生产的瑞倍适、天康生物生产的天支净和瑞普生物生产的优瑞适等，采用的毒株不一样，效果也不一样。上市的弱毒苗主要有168株和RM48株，免疫效果以细胞免疫和黏膜免疫为主[22]。

基因工程苗由于不需要添加病原，使用了DNA的重组技术，比传统的灭活苗，尤其是弱毒苗要更安全，完全不同于传统的商业疫苗，因此，是许多国内外研究的热点。目前，国内外关于基因工程苗，大部分还是处于研发阶段，还没有商品上市，主要是因为基因工程苗比较复杂，需要对Mhp黏附因子开展详细的研究。目前，研究人员针对Mhp黏附因子开展疫苗研究，其中主要研究的Mhp黏附因子有P97、P36、P42、P46和P95。目前有单黏附因子亚单位疫苗、腺病毒表达亚单位疫苗和重组沙门氏菌疫苗，详细见表1[22-24]。

表1 Mhp黏附因子基因工程苗

我国很多学者也对P97基因工程疫苗展开研究工作。2019年，郭芸芸等[25]通过体外表达获得了两种重组蛋白pCold-F7-CTB、pET32a-P97-R1，与口蹄疫病毒灭活抗原混合免疫接种小鼠，检测重组蛋白对口蹄疫灭活疫苗的增强效果，结果表明，混合接种小鼠血清中IgG明显增加，重组蛋白混合接种小鼠，对口蹄疫疫苗有协同作用。韦艳娜等[26]通过把扩增得到的猪肺炎支原体P97基因融合至霍乱毒素B亚单位基因下游，构建了重组质粒pET-CTB-P97R1，然后与活疫苗免疫接种小鼠，检测特异性抗体水平，结果表明，重组蛋白免疫多小鼠血清IgG抗体显著高于对照组，能够增强Mhp疫苗的免疫效力。陶宇[27]通过昆虫杆状病毒表达系统的表面展示技术，在杆状病毒囊膜上同时表达猪肺炎支原体的P97 R1等蛋白，以及PCV2的Cap蛋白，并将得到的重组病毒蛋白rvAc-P97R1P46P42-Cap作为弱毒苗分别免疫小鼠和仔猪，小鼠产生特异性抗体IgG，脾淋巴细胞产生显著的增殖效果，也同时能引起仔猪产生显著的特异性抗体和细胞因子(IL-4和TNF-γ)，重组病毒蛋白具有较好的免疫原性。

4 小结

目前关于P97蛋白研究不少，已经达成共识的是，P97蛋白为Mhp的主要黏附因子，P97R1区是具有黏附纤毛的功能区，并有非常好的免疫原性。同时，将P97蛋白与其他Mhp抗原蛋白，甚至是其他病原疫苗进行重组，能够提高机体的特异性抗体水平，增强免疫效力，同时还能起到协同作用。但P97蛋白使动物感染Mhp的机理及P97蛋白工程基因疫苗在临床应用推广的安全评价方面需要进一步进行动物试验。