二斑叶螨为害对草莓叶片H2O2、MDA含量以及部分防御酶活性的影响

陈 鹏，刘奇志

(1. 山东省农业科学院植物保护研究所，山东省病虫害生物防治工程技术研究中心，济南 250100；2. 中国农业大学植物保护学院，北京 100193)

草莓是蔷薇科Rosaceae草莓属Fragaria的多年生草本植物，属于经济和营养价值极高的浆果类果树。随着人们生活水平的提高，草莓受到越来越多人的青睐，已逐渐成为国民水果。近年来，我国草莓栽种面积越来越大，与之相伴的草莓病虫害也是日益严重，给果农带来了巨大的经济损失。其中，叶螨是草莓生产中面临的主要害虫之一(徐可, 2019)。

草莓生产过程中可以受到多种叶螨危害，如截形叶螨Tetranychustruncatus(洪雪, 2012)、朱砂叶螨Tetranychuscinnabarinus(杨金生等, 1990)和二斑叶螨T.urticae(朱亮等, 2013)等。二斑叶螨是危害最为广泛和严重的一种。曹利军等(2018)将华北、华中、华东和西南地区中12个草莓产区危害的叶螨进行分子鉴定后发现，这些地区的为害叶螨均为二斑叶螨，其种内遗传多样性不高(曹利军等, 2018)。

二斑叶螨主要为害草莓植株的茎、叶和花等，主要位于叶片的背面刺吸汁液，导致叶片表面出现黄色斑点，最终致使整个草莓叶片变得干枯而呈褐色，受害草莓植株会出现矮化早衰、果实萎缩等现象(杨金生等, 1990)。近年来，由于化学农药的不规范使用，大大加速了该螨对多数化学药剂的抗药性(刘学辉等, 2008; 耿书宝等, 2014)，因此迫切需要新的绿色防控方式。寄主植物与害虫之间的相互作用关系是生态系统的重要组成部分之一，也是目前研究热点问题。利用植物自身防御机制抗螨是目前农业研究的热点领域之一，可以很好的避免化学防治所带来的诸多问题，对促进农业的可持续发展具有重要意义。

当寄主植物遭受害虫胁迫时，植物会通过改变自身体内的一系列生理生化反应来进行防御(张廷伟等, 2013; 帕提玛·乌木尔汗等, 2016)。虫害导致植物大量释放活性氧，如H2O2等，从而引发植物细胞发生氧化胁迫(Mittapallietal., 2007)。丙二醛(MDA)能够与细胞内的各种成分发生反应，可以用来指示细胞膜脂的过氧化程度，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)是植物氧化酶促清除系统中的抗氧化酶，参与活性氧自由基的清除(Tewarietal., 2002; 谭永安等, 2010; 李林懋等, 2014)。因此，当植物遭受害虫侵害后体内MDA的含量以及SOD、POD和CAT等酶活性会发生显著变化(从春蕾等, 2014; 陈丽慧, 2016) 。如二斑叶螨为害棉花Gossypiumspp.和番茄Lycopersiconesculentum等时，植物体内的POD和CAT等防御酶活性可被诱导升高(帕提玛·乌木尔汗等, 2016; 温娟等, 2017)。端大蓟马Megalurothripsdistalis为害豆科植物后，其叶片内的SOD、POD、CAT活性和MDA的含量均发生变化(沈登荣等, 2017)。

本文主要研究二斑叶螨为害草莓叶片所引发的草莓体内过氧化氢(H2O2)、丙二醛的含量及部分防御酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的变化规律，探讨草莓叶片对二斑叶螨为害的生理生化响应机制，以期为揭示二斑叶螨与寄主草莓植株之间的相互作用关系奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

二斑叶螨虫源取自北京农林科学院林业果树科学研究院内草莓大棚并经过鉴定的野生品种。经鉴定后，在人工气候培养箱(光周期L ∶D=14 ∶10; 相对温度25℃±1℃; 相对湿度70%～80%)利用豇豆Vignaunguiculata(Linn.) Walp.植株连续饲养多代。

本实验选用草莓品种“红颜”，草莓植株采用聚乙烯盆栽(16 cm×15 cm)，每个盆中加入约2 kg沙壤土，选择长势相对一致的草莓苗进行定植，其它条件均与草莓大棚中相一致。

1.2 二斑叶螨接种实验

选取长势一致、健康的草莓苗(叶片大小、数量基本一致)进行接种实验。选用的二斑叶螨为雌成螨，按5头/叶、15头/叶和25头/叶的虫口密度分别进行接种，叶片边缘涂抹聚四氟乙烯。以未接种二斑叶螨的叶片作为对照。以接种时间为起始，分别在接种后的24 h、48 h和72 h进行取样，各处理重复3次，液氮速冻，-80℃冰箱保存备用。

1.3 H2O2和丙二醛(MDA)含量测定

H2O2存在390 nm的吸收峰，利用KI法测定草莓叶片中H2O2的含量；按照李合生(2000)的方法，使用硫代巴比妥酸(TBA)法测定丙二醛(MDA)的含量(李合生, 2000)。

1.4 草莓叶片防御酶活性测定

超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定参考萧浪涛等(2005)的氮蓝四唑(NBT)法；过氧化物酶(POD)活性的测定参考李合生(2000)愈创木酚法；过氧化氢酶(CAT)活性测定参考李合生(2000)的方法。

1.5 数据分析

用Microsoft Excel 2016、GraphPad Prism 7.0和SPSS 20.0软件进行数据处理和分析。二斑叶螨不同时间和虫口密度为害对草莓叶片H2O2和MDA的含量及部分防御酶活性的影响进行非参数单因素ANOVA检验，利用Kruskal-Wallis法比较不同处理间的显著性。

2 结果与分析

2.1 二斑叶螨为害对草莓叶片H2O2含量的影响

与对照草莓相比，在二斑叶螨持续为害草莓叶片24 h、48 h和72 h时，不同密度的二斑叶螨均会导致草莓叶片H2O2的含量显著升高(P<0.05)；当为害时间分别为24 h和48 h时，二斑叶螨密度分别为15头/叶和25头/叶时的受损叶片中H2O2的含量没有显著性差异；为害时间为72 h时，二斑叶螨为5头/叶和25头/叶时的受损叶片中H2O2的含量没有显著性差异，二斑叶螨密度为25头/叶的受损叶片中H2O2的含量比15头/叶中下降了约15.45%。不同密度的二斑叶螨为害的草莓叶片中H2O2的含量均显著高于对照(P<0.05)，但与取食时间关系不大(P>0.05)(图1)。

图1 二斑叶螨为害对草莓叶片中H2O2含量的影响Fig.1 Effect of the damage of Tetranychus urticae on H2O2 content in strawberry leaves注：图中大写字母不同表示在同一时间不同为害密度下在0.05水平上差异显著，小写字母不同表示在同一密度不同时间为害下在0.05水平上差异显著。下图同。Note: Different upper-case letters indicated significant difference at the same feeding time but different population densities (P<0.05); different lower-case letters indicated significant difference at the same population density but different feeding time (P<0.05). Same below.

2.2 二斑叶螨为害对草莓叶片MDA含量的影响

草莓受到二斑叶螨为害后，草莓叶片MDA的含量随着时间的延长而呈现先升后降的趋势，仅在48 h时发生显著变化(图2)。当为害时间达到48 h时，MDA的含量达到最高峰，此时MDA的含量与二斑叶螨的密度密切相关。当二斑叶螨密度为15头/叶时，MDA的含量比对照增加了75.28%，25头/叶时，MDA的含量约是对照的3.6倍。其它为害时间，各虫口密度二斑叶螨为害下草莓叶片的MDA含量均未发生明显变化(P>0.05)。

图2 二斑叶螨为害对草莓叶片中MDA含量的影响Fig.2 Effect of the damage of Tetranychus urticae on MDA content in strawberry leaves

2.3 二斑叶螨为害对草莓叶片SOD活性的影响

草莓叶片SOD的活性与为害的二斑叶螨密度密切相关。与对照相比，草莓叶片受到二斑叶螨持续为害24 h、48 h和72 h，当二斑叶螨的密度达到15头/叶和25头/叶时，草莓叶片内的SOD活性显著升高(P<0.05)；SOD的活性在48 h时达到最高峰，SOD活性的约是对照的10倍(图3)。当二斑叶螨密度为5头/叶时，SOD活性在为害时间达到48 h和72 h时显著性高于对照；15头/叶时，SOD活性仅在为害时间达到24 h和48 h时显著性高于对照，72 h时有所下降；25头/叶时，24 h、48 h和72 h SOD活性的活性均高于对照，并随时间呈现先升后降的趋势(图3)。

图3 二斑叶螨为害对草莓叶片中SOD活性的影响Fig.3 Effect of the damage of Tetranychus urticae on SOD activity in strawberry leaves

2.4 二斑叶螨为害对草莓叶片POD活性的影响

二斑叶螨取食24 h后，仅当二斑叶螨的密度达到15头/叶，草莓叶片POD活性显著高于对照；为害时间为48 h时，密度为15头/叶和25头/叶为害的草莓叶片POD活性显著高于对照，但两者之间没有显著差异；为害时间为72 h时，3种密度下POD活性均显著高于对照，三者之间没有显著差异。不同二斑叶螨密度为害的草莓叶片POD活性均随着时间的延长而有所升高。不同密度的二斑叶螨均在为害72 h时达到最高峰，但二斑叶螨密度为25头/叶时，POD最高峰的活性显著低于5头/叶和15头/叶时的活性(P<0.05)。当密度为5头/叶时，POD活性仅在72 h显著升高；15头/叶时，POD活性在48 h和72 h均显著升高；当密度为25头/叶时，POD在第24 h即可被显著激活，POD活性达到对照的2倍(图4)。

图4 二斑叶螨为害对草莓叶片中POD活性的影响Fig.4 Effect of the damage of Tetranychus urticae on POD activity in strawberry leaves

2.5 二斑叶螨为害对草莓叶片CAT活性的影响

草莓叶片中CAT的活性与为害二斑叶螨的密度有关。当草莓叶片受到二斑叶螨持续为害24 h时，3个密度下CAT活性均显著高于对照，但15头/叶和25头/叶为害的叶片CAT活性没有显著差异；为害48 h和72 h时，二斑叶螨密度为15头/叶和25头/叶时，CAT活性显著高于对照和5头/叶。二斑叶螨密度为5头/叶时，CAT的活性仅在24 h时有所升高，比对照增加约44.15%。当二斑叶螨密度达到15头/叶和25头/叶时，草莓叶片CAT活性显著升高(P<0.05)，且随为害时间的延长其活性持续升高，72 h达到最高峰，分别是对照的2.39倍和4.27倍(图5)。

图5 二斑叶螨为害对草莓叶片中CAT活性的影响Fig.5 Effect of the damage of Tetranychus urticae on CAT activity in strawberry leaves

3 结论与讨论

植物进化过程中逐步形成了一套复杂完整的抵御害虫侵害的防御机制，其中诱导防御策略是植物自我保护的重要一种(温娟等, 2017)。植物体内部分物质和防御酶活性的改变，均可以达到抗虫的目的(杨振德等, 2003; 李新岗等, 2008)。本文研究发现，二斑叶螨为害的草莓的叶片内H2O2和MDA的含量以及SOD的活性随着时间的延长而呈现先升后降的趋势，POD和CAT的活性随时间延长不断升高，同时这些变化均与虫口密度有关。

植物体内H2O2和MDA的含量是植物遭受逆境胁迫时衡量细胞损伤程度的重要指标(Yamamoto, 2001; Jonesetal., 2006)。H2O2在植物抗逆过程中发挥着重要作用，植物在遭受胁迫时体内会产生H2O2，H2O2与植物的过敏反应(HR)密切相关。研究表明H2O2对植物体同时具有保护和毒害的双重作用，低浓度时可以作为信号分子参与植物胁迫响应，而当植物细胞内H2O2浓度较高时则会对细胞产生毒害作用(Hancock, 2002)。H2O2在植物抗虫过程中可以起着一定作用，如能够减轻其玉米螟Ostrinianubilalis对转基因玉米的危害(Ramputhetal., 2002)。本文研究中，二斑叶螨为害的草莓叶片中H2O2含量在持续为害24 h即有所升高，这应该是草莓抵御不良环境的一种有效方式。草莓叶片中H2O2含量的变化与二斑叶螨的虫口密度密切相关，但当密度大于15头/叶时，不再具有密度效应。MDA用来表示植物遭受胁迫时细胞膜的损伤程度，是植物体内脂质过氧化作用的产物(韩忠明等, 2016)。本文研究表明二斑叶螨为害可以引发MDA含量的增加，造成细胞损伤。二斑叶螨为害过程中，仅在48 h时MDA的含量达到最大值，此时与虫口密度密切相关，之后恢复到初始含量，此结果与端大蓟马取食胁迫不同豆科植物后MDA的含量变化基本类似，后者在72 h达到最大值，之后开始下降(沈登荣等, 2017)。

当植物细胞受到过氧化损伤时，植物会主动调节自身保护酶活性来消除活性氧自由基带来的伤害(桑子阳等, 2011; 蒋林等, 2012; 姜宗庆等, 2019)。SOD、POD和CAT是植物遭受环境胁迫时起到抵御作用的主要保护酶(陈珺等, 2014; 井大炜, 2014)。SOD是植物在逆境条件下最主要的自由基清除剂，主要的生理功能是延缓衰老(Younetal., 1996)。POD是植物抗逆反应过程中酶促防御系统的关键酶之一，在植物抗虫反应起重要作用(Tscharntkeetal., 2001; 温娟等, 2017)。CAT是植物防御体系一种重要的保护酶，主要用于H2O2分解，清除体内多余的H2O2(帕提玛·乌木尔汗等, 2016)。植物体内的SOD主要用于催化体内超氧阴离子的歧化反应,从而产生氧气和过氧化氢，POD和CAT则可以清除生物体内产生的多余的H2O2(Saitanisetal., 2002)。本文研究中，二斑叶螨为害草莓叶片中SOD活性随二斑叶螨密度的增加而升高，当达到25头/叶时更为显著，随时间变化则呈现先升后降的趋势。POD和CAT的活性与二斑叶螨的危害密度有关，POD活性的密度效应主要出现在持续为害24 h和48 h，CAT活性变化具有显著的低密度效应，当虫口密度小于15头/叶时更为显著。此外，两者均随着时间的推移其活性不断升高。二斑叶螨为害叶片内H2O2含量的升高与SOD活性的升高密切相关，POD和CAT活性显著升高，则可能与二斑叶螨为害叶片内H2O2显著升高的原因，主要用于分解多余的H2O2。这些结果与此前有关害虫为害植物的结果相似，如皖棉小黄花JasminumnudiflorumLindl.叶片在绿盲蝽ApolyguslucorμmMeyer-Dür.为害后，叶片中的POD活性显著增加；二斑叶螨侵害番茄叶片后，叶片POD活性随着密度的增加逐步升高，随时间延长而先升后降；朱砂叶螨取食豇豆幼苗前期，CAT活性显著升高(梁为等, 2010; 毛红等, 2011; 温娟等, 2017)。

本文重点研究了二斑叶螨为害所导致的草莓体内生理生化的反应。当遭遇虫害胁迫时，草莓可以通过改变自身体内化学成分的含量(如H2O2)以及激活防御酶活性(如SOD、POD和CAT)来抵抗虫害胁迫。但草莓体内这些变化对二斑叶螨所产生的影响，还有待于进一步研究。