美凤蝶成虫虫体挥发物的主要成分与变化动态研究

刘 杰，李明涛，陈顺安，姚 俊，石 雷，陈晓鸣

(中国林业科学研究院高原林业研究所，国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室, 昆明 650224)

昆虫的嗅觉在种内通讯、探测捕食者、寻找寄主、躲避天敌及交配、取食、产卵等行为活动中发挥重要作用(Liuetal., 2012; Lietal., 2018a; Lietal., 2018b; Zengetal., 2018; Duanetal., 2019; Muhammadetal., 2020)。与视觉、听觉等常用交流方式相比，嗅觉、味觉等化学通讯也被多数生物利用(Wyatt, 2003; 2009; Stéphanieetal., 2014)。通常，挥发物作为嗅觉信号能传达潜在配偶质量、身份等多种信息，包括生理状态(Rantalaetal., 2003)、年龄(Thomas, 2011)、交配状态(Nieberdingetal., 2012)和性别差异(Michelleetal., 2018)等，多用于评估配偶吸引力和物种识别(Wyatt, 2003; Johansson and Jones, 2007; Anderssonetal., 2007)。

鳞翅目昆虫常借助虫体挥发物提供的嗅觉信号进行配偶选择和雌雄个体识别，如雌成虫产生性信息素远距离吸引雄性(Millar, 2000; Andoetal., 2004; Johansson and Jones, 2007; Millaretal., 2010)。蝴蝶在求偶过程中通过虫体挥发物进行同性和异性的识别(Pliske, 1975a; Silberglied and Taylor, 1978; Costanzo and Monteiro, 2007; 李承哲, 2017)，促进雌蝶对雄蝶的接受(Pliske, 1975a; Nishidaetal., 1996; Mellström and Wiklund, 2009)，区别雌蝶的交配状态(Vane and Boppré, 1993; Thomas, 2011)及作为种间生殖隔离机制(Pliske, 1975a; Silberglied and Taylor, 1978; Grulaetal., 1980)。但是，在蝴蝶研究中，关于虫体挥发物在蝶类物种识别中的作用及何种挥发物参与了物种识别报道相对较少。

美凤蝶Papiliomemnon隶属于鳞翅目Lepidoptera凤蝶科Papilionidae凤蝶属Papilio美凤蝶亚属Menelaides，羽化3 d即可交配(作者观察)，人工饲养时可用蜂蜜水补充营养(陈晓鸣等, 2008)。美凤蝶是著名的观赏昆虫，具有很高的观赏价值和经济价值，是目前人工养殖及市场供应的主要蝴蝶品种，特别是在活体蝴蝶观赏园中应用较多。美凤蝶在国内分布较广，主要分布于南方各地，在国外广布于日本、东南亚和印度等地。迄今为止，国内外还没有对美凤蝶虫体挥发物及其求偶时嗅觉信息利用的研究，关于化学信息在美凤蝶物种识别中的作用及何种化合物参与美凤蝶物种识别未见报道，探索美凤蝶雌雄蝶羽化成虫不同时期挥发性成分及变化规律，揭示嗅觉信息在美凤蝶求偶过程中所扮演的角色及探索美凤蝶求偶的嗅觉行为机制，为筛选出对美凤蝶具有生物活性的引诱剂提供基础，同时为开展蝴蝶繁育及景观营造提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点

试验地点位于云南省昆明市盘龙区白龙寺，中国林业科学研究院高原林业研究所(102°45′E，25°03′N)，当地海拔1 930 m，年平均气温15℃～16℃，年平均降雨量900～1 000 mm，属于亚热带高原季风气候。蝴蝶交配时及交配后，行为学观察试验在一个长、宽和高度分别为(8 m× 4 m× 5 m)的网室内进行。网室内透光良好，光照均匀。

1.2 试验材料

试验用美凤蝶P.memnon蛹来自于中国林业科学研究院高原林业研究所元江试验站人工饲养的种群，美凤蝶幼虫用新鲜柑橘Citrusreticulata叶喂养，饲养条件为光周期L ∶D=13 h ∶11 h，温度26℃±2℃，相对湿度50%～70%。蝴蝶成虫饲养在人工气候室，供试蝴蝶均为羽化后的健康成虫。

1.3 虫体挥发物检测时期

将羽化成虫按交配前、交配时、交配后1 d和交配后3 d分组，测试4个不同时期虫体挥发物。

1.3.1交配前虫体挥发物的检测

雌雄无干扰组：雌雄蝶羽化后单放，用羽化后2 h个体作为检测对象进行挥发物的检测。

1.3.2交配时虫体挥发物的检测

雌雄无干扰组：雌雄蝶羽化后单放，用羽化后3 d未交配个体作为检测对象进行挥发物的检测(观察中发现美凤蝶羽化后3 d开始交配)。

1.3.3交配后1 d虫体挥发物的检测

雌雄干扰组：雌雄蝶来自于网室大棚自然交配后的种群，雌雄蝶交配后1 d进行虫体挥发物检测。

1.3.4交配后3 d虫体挥发物的检测

雌雄干扰组：雌雄蝶来自于网室大棚自然交配后的种群，雌雄蝶交配后3 d进行虫体挥发物检测。

1.4 虫体挥发物采集与检测方法

利用固相微萃取(solid-phase micro extraction，SPME)方法吸附并采集虫体挥发物：先将待测试雌、雄活蝶(2头)分别放入广口瓶(高10 cm，开口直径3 cm，体积80 mL)，用“4号”LDPE材质塑料膜将广口瓶封口，将PDMS/DVB固相微萃取头(65 μm，Supelco，Bellefonte，PA，USA)扎穿塑料并固定，吸附时间为1 h。空的广口瓶作为空白对照。上述挥发物检测重复3次。

使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析虫体挥发物：参考李承哲(2017)的方法略有改动。每次进样前需将SPME萃取头在GC进样口老化(250℃，10 min)，采用TR-5MS色谱柱(内径：0.25 mm，厚度：0.25 μm，长度：30 m)，程序为40℃保持2 min，升温到120℃保持2 min(4℃/min)，最后升到230℃保持5 min(5℃/min)，进样口温度为250℃，载气He的气压为69 kPa。

挥发物定性方法：以美国国家标准技术研究所(National Institute of Standards and Technology，NIST，http://webbook.nist.gov/chemistry/)质谱库检索为主，同时结合人工解析质谱图；挥发物的定量计算：采用峰面积归一化法，即计算样品组分峰面积占总峰面积的百分比，得到相对含量。计算挥发性成分的保留指数，并与文献值进行比对。保留指数(linear retention index，LRI或RI)计算公式如下：

LRI—保留指数；

tx—待测组分的保留时间，min；

tn—具有n个碳原子的正构烷烃的保留时间，min；

tn+1—具有n+1个碳原子的正构烷烃的保留时间，min。

2 结果与分析

2.1 交配前虫体挥发物的组成及相对含量

雌雄蝶羽化1 d分别检测到14种和16种挥发物，共有的挥发物有14种，其中反-2-辛烯醛含量最高，雌蝶含量为59.88%，雄蝶含量为77.99%，其次是2-甲基烯丙醇，雌蝶含量为14.47%，雄蝶含量为8.42%。雄蝶特有的挥发物有2种，未检测到雌蝶特有的挥发物(表1)。检测到的挥发物主要包括烷烃类、芳香烃、醇类、醛类、酮类、脂类、萜类、酸类物质和醌类9类，醛类和醇类含量最高，醛类物质雌蝶含量为70.86%、醛类物质雄蝶的含量为85.34%、醇类物质雌蝶含量为14.62%、醇类物质雄蝶含量为8.42%(表2)。

表1 美凤蝶成虫虫体在羽化后不同时间挥发物种类相对含量Table 1 Relative contents of volatile compounds at different times after eclosion in the adults of Papilio memnon

续表1 Continued table 1

2.2 交配时虫体挥发物的组成及相对含量

雌雄蝶羽化3 d分别检测到24种和21种挥发物，共有的挥发物有20种，其中反-2-辛烯醛含量最高，雌蝶含量为53.75%，雄蝶的含量为39.62%，其次是2-甲基烯丙醇和1-二十醇，雌蝶体内2-甲基烯丙醇含量为9.36%，雄蝶体内2-甲基烯丙醇的含量为11.04%，雌蝶体内1-二十醇含量为10.46%，雄蝶体内1-二十醇含量为21.13%。雌蝶特有的挥发物有4种，分别是1-苯基-1-丙炔(0.23%)、异辛酸(2.44%)、紫苏醛(0.99%)、1-茚酮(0.66%)，雄蝶特有的挥发物β-石竹烯(0.16%)(表1)。检测到的挥发物主要包括烷烃类、炔烃类、芳香烃、醇类、醛类、酮类、脂类、萜类、酸类和酚类10类，醛类和醇类含量最高，醛类物质雌蝶含量为55.01%、醛类物质雄蝶的含量为39.76%、醇类物质雌蝶含量为21.53%、醇类物质雄蝶含量为32.56%(表2)。

2.3 交配后1 d虫体挥发物的组成及相对含量

雌雄蝶交配1 d均检测到8种挥发物，共有的挥发物有5种，其中反式-2-壬烯酸含量最高，雌蝶含量为33.88%，雄蝶的含量为51.80%，其次是香豆素-3-羧酸乙酯，雌蝶含量为50.00%，雄蝶的含量为16.78%。雌蝶特有的挥发物有3种，分别是衣康酸(5.26%)、1-茚酮(1.65%)、正十四烷(1.51%)，雄蝶特有的挥发物有3种，分别是辛酸十六烷酯(12.01%)、3a-羟基-5b-雄甾烷-17-酮(0.53%)、26-二叔丁基对甲酚(0.05%)(表1)。检测到的挥发物主要包括烷烃类、芳香类、醛类、酮类、脂类、酸类6类挥发物，酯类和酸类含量最高，其中酯类物质雌蝶含量为52.32%、酯类物质雄蝶含量为30.16%、酸类物质雌蝶含量为39.14%、酸类物质雄蝶含量为51.80%(表2)。

2.4 交配后3 d虫体挥发物的组成及相对含量

雌雄蝶交配3 d分别检测到14种和22种挥发物，共有的挥发物有8种，其中反式-2-壬烯酸含量最高，雌蝶含量为29.21%，雄蝶含量为4.17%，其次是衣康酸，雌蝶含量为8.79%，雄蝶含量为8.65%。雌蝶特有的挥发物有6种，分别是十三烷醇(2.70%)、5-甲基-2-(1-甲乙烯基)-4-己烯-1-醇(2.70%)、1，2，3，4-甲基苯(0.45%)、巴伦西亚橘烯(5.08%)、26-二甲基-2,4,6-辛三烯(0.58%)、二十四烷(17.48%)，而雄蝶特有的挥发物高达14种(表1)。检测到的挥发物主要包括烷烃类、烯烃类、芳香类、醇类、酮类、脂类、萜类、酸类和酚类9类挥发物，酸类和醇类含量最高，雌蝶虫体中酸类物质含量为51.25%、雄蝶虫体中酸类物质含量为84.20%、雌蝶虫体中醇类物质含量为14.76%、雄蝶虫体中醇类物质含量为6.62%(表2)。

表2 美凤蝶成虫虫体在羽化后不同时间挥发物归类Table 2 Classification of volatile compounds at different times after eclosion in the adults of Papilio memnon

比较发现雌雄蝶羽化后共检测出12类挥发物，其中芳香类、酯类、酸类3类在雌雄蝶羽化后均有出现(表2)。芳香类虽然一直存在但是相对含量一直较低，酯类在雌雄蝶交配后1 d达到最大值，酸类在雌雄蝶虫体交配后3 d达到最大值。炔烃类仅在交配时雌蝶虫体中检测到，醌类仅在交配前雌雄中检测到。雌蝶交配前后含量最多，挥发物有5类，分别是醇类、醛类、酯类、酸类及烷烃类，雄蝶交配前后含量最多，挥发物有4类，分别是醇类、醛类、酯类、酸类(表2)。

交配前雌雄蝶优势挥发物为醇类、醛类(图1-A, B)。雌雄蝶虫体挥发物中醇类含量在交配前及交配时随羽化时间的增加而上升，交配后1 d消失，交配后3 d又呈现上升趋势(图1-A)。雌雄蝶虫体挥发物中醛类含量随羽化时间的增加而逐渐减少，雌蝶醛类挥发物交配后1 d消失，雄蝶醛类挥发物交配后3 d消失(图1-B)。雌雄蝶共有且含量最高的挥发物均在交配后消失，雌蝶虫体内2-甲基烯丙醇含量在在交配前及交配时随羽化时间的增加而减少，雄蝶虫体内2-甲基烯丙醇含量在交配前及交配时随羽化时间的增加而增加(图1-C)。雌雄蝶虫体内反-2-辛烯醛、1-二十醇在交配前及交配时含量的变化规律与醇类、醛类的变化规律类似(图1-D, E)。

图1 美凤蝶成虫不同时期主要挥发物(醇类；醛类；2-甲基烯丙醇；反-2-辛烯醛；1-二十醇)的含量变化Fig.1 Variations in the main volatile compounds (Alcohols; Aldehydes; 2-Methylallyl alcohol; (2E)-2-Octenal; 1-Eicosanol) of the adults of Papilio memnon in different periods

交配时雌蝶虫体特有的4种挥发物(1-茚酮、异辛酸、1-苯基-1-丙炔、紫苏醛)及雄蝶特有的1种挥发物(β-石竹烯)在交配后3 d均消失(图2-A, E)。交配前及交配后1 d，紫苏醛在雌雄蝶体内均存在，而交配时仅在雌蝶虫体检测到(图2-A)。交配前，β-石竹烯在雌雄蝶体内均存在，交配时仅在雄蝶虫体检测到，交配后则完全消失(图2-B)。雌蝶虫体特有异辛酸、1-苯基-1-丙炔交配后1 d在雌蝶体内消失(图2-C, D)，而1-茚酮在交配后1 d在雌蝶体内仍然存在(图2-E)。

图2 美凤蝶成虫不同时期特有挥发物(紫苏醛；β-石竹烯；异辛酸；1-苯基-1-丙炔；1-茚酮)的含量变化Fig.2 Changes in contents of unique volatile compounds (Perillaldehyde; β-Caryophyllene; 2-Ethylcaproic acid; Phenylpropyne; 1-Indanone) of the adults of Papilio memnon in different periods

3 结论与讨论

日龄是影响昆虫交配及繁殖的重要因素(Tanneretal., 2019)。昆虫的最佳交配日龄因其种类不同而存在差别。日龄增加使昆虫交配能力减弱，其原因可能与昆虫体内精原细胞耗尽导致交配能力降低有关(闫喜中等, 2014)。本研究通过对美凤蝶交配前、交配时及交配后虫体挥发物检测，分析了美凤蝶成虫虫体挥发物的动态变化规律。结果显示羽化后雌雄蝶挥发物成分和相对含量都有较大的变化。羽化后的雌雄蝶可检测到醇类、醛类、酯类、酸类等12类挥发物，其中芳香类、酯类和酸类在羽化后均有出现，挥发物的动态变化反映了美凤蝶生理状态、年龄、交配状态、性别差异及生活环境因素等。

交配前，蝴蝶刚羽化还处于补充营养和促进生殖器官发育阶段(王翻艳, 2015)，对蜜源植物的访问才是主要任务，对成虫气味的追逐并不是主要的。本研究发现此阶段美凤蝶共有挥发物数量多而特有挥发物少或无，交配前雌雄蝶醛类、醇类含量最高。雌雄蝶共有的含量相对较高的挥发物为2-甲基烯丙醇和反-2-辛烯醛，雄蝶挥发物种类多于雌蝶。

交配时，蝴蝶羽化3 d已经达到性成熟阶段，求偶交配是蝴蝶的主要任务，对蝴蝶成虫气味的追逐是主要的。交配中雌雄蝶虫体醛类、醇类含量最高，共有挥发物(2-甲基烯丙醇、反-2-辛烯醛、1-二十醇)的相对含量较高，目前关于2-甲基烯丙醇、反-2-辛烯醛、1-二十醇这3种挥发物在前人研究中尚未见报道。交配时雌蝶特有的挥发物有4种，雄蝶特有的挥发物有1种。结合前人的研究结果，Grula等(1980)研究发现菲罗豆粉蝶Coliasphilodice雄蝶翅膀分泌的酯类(肉豆蔻酸正己酯n-hexyl myristate)作为物种识别信号区分同种或异种雄蝶。黑纹粉蝶Pierismelete雌蝶依靠挥发物(雄蝶翅膀释放的物种特异性气味)来识别配偶(Kan and Hidaka, 1997)。透翅蝶Ithomiine雄蝶利用从味刷释放的内酯来识别同类雄蝶(Pliske, 1975b)。偏瞳蔽眼蝶Bicyclusanynana雄蝶翅膀上的香鳞释放的挥发物会干扰雄雄蝶的识别，说明挥发物可能参与雄雄识别过程(Costanzo and Monteiro, 2007)。初步推测2-甲基烯丙醇、反-2-辛烯醛、1-二十醇可能用于美凤蝶求偶时同性的识别，雌雄蝶特有挥发物(1-苯基-1-丙炔、异辛酸、紫苏醛、1-茚酮、β-石竹烯)为求偶时异性的识别提供了某种暗示。

交配后，雌蝶进入大量耗能的产卵阶段，需要大量取食补充、积累营养，并寻找合适的寄主植物进行产卵，繁衍后代的使命使蝴蝶对植物挥发物更为敏感。交配后雌雄蝶虫体挥发物的种类和相对含量发生了极大的变化，挥发物种类锐减到8种，挥发物种类也由醛、醇类为主转变为脂、酸类为主。这种变化进一步证明了醛类、醇类肩负着蝴蝶配偶识别的作用。交配后蝴蝶进入孕卵生殖阶段，也预示着它们使命的完成，醇类、醛类物质彻底消失。交配后3 d雌雄蝶特有的挥发物均消失，说明雌蝶进行产卵，雄蝶完成自己的使命，雌雄蝶不需要再利用特有的挥发物吸引异性。

蝴蝶求偶时利用共有挥发物识别同类及同性，通过雌雄蝶特异性挥发物来辨别同种异性(王翻艳, 2015; 李承哲, 2017; 王华, 2017)，通过对美凤蝶交配前后挥发物变化规律的分析，推测美凤蝶雌雄蝶成虫共有挥发物(2-甲基烯丙醇、1-二十醇和反-2-辛烯醛)可能用于识别同种及同性。雌蝶特有挥发物紫苏醛及雄蝶特有挥发物β-石竹烯，在交配前雌雄蝶虫体均存在，雄雌蝶对此气味很熟悉，雄蝶很容易通过紫苏醛识别雌蝶，雌蝶很容易通过β-石竹烯识别雄蝶。交配时雌蝶特有的挥发物1-茚酮、异辛酸、1-苯基-1-丙炔交配前不存在，交配后消失，推测这3种物质可能是性信息素物质，而雄蝶充分利用雌蝶特有的这几种挥发物进行同种异性的识别。

由于昆虫生境及个体之间存在差异，所以测得的成分也有很大不同。美凤蝶虫体醌类仅在羽化1 d雌雄蝶虫体存在，推测其可能是美凤蝶雌雄蝶未达到性成熟的标志性挥发物，炔类物质仅在交配时雌蝶虫体存在，推测其可能是雌蝶性信息素物质。然而这些化合物仍然需要做进一步的分离、鉴定，如电生理试验和行为学试验才能确定它们的具体作用，这也是我们下一步需要进行的工作。