貊志杰,邓帅军,史素娟,毛静静,袁佳苹,王 帆,张 鸽,晁江涛,崔萌萌,王 倩*,刘贯山*
烤烟品种中烟特香301烤后烟叶石油醚提取物分析
貊志杰1,2,邓帅军1,2,史素娟3,毛静静1,2,袁佳苹1,王 帆4,张 鸽4,晁江涛1,崔萌萌1,王 倩1*,刘贯山1*
(1.中国农业科学院烟草研究所,青岛 266101;2.中国农业科学院研究生院,北京 100081;3.上海烟草集团有限责任公司技术中心北京工作站,北京 101121;4.中国科学院青岛生物能源与过程研究所,青岛 266101)
为进一步明确特征香韵烤烟品种中烟特香301与中烟100香韵差异的物质基础,采用气质联用技术对二者中部烟叶的石油醚提取物进行测定,并进行了主成分分析(PCA)和偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)。结果表明,中烟特香301和中烟100烤后烟叶石油醚提取物中各鉴定到99和98种化合物,其中共有化合物87种,中烟特香301和中烟100各自特有化合物12和11种。中烟特香301的酯类、酸类、醇类、酮类、烯类和醛类化合物的相对含量均高于中烟100,共有化合物中,二者含量差异化合物有29种,二氢猕猴桃内酯、巴伦西亚橘烯、香叶基芳樟醇、巨豆三烯酮等28种成分的含量显著高于中烟100。该结果为揭示中烟特香301香韵风格形成的物质基础提供了参考。
中烟特香301;石油醚提取物;香气;差异分析
烟叶的石油醚提取物是以石油醚为溶剂,从烟叶中萃取得到的有机混合物质[1],其主要成分是脂肪、精油、树脂、蜡质、类脂物、色素、甾醇和有机酸等[2-3],可以在一定程度上反映烟叶香气品质[4-5]。烤烟中不同类型的香韵取决于烟叶所含的致香物质[6],研究表明,烟叶的石油醚提取物与烟叶品质呈正相关关系,其含量越高,烟叶的香气量越足,香气质越好[3, 7-10]。因此,系统分析烟叶的石油醚提取物成分有助于解析烟叶香韵形成的物质基础。
中烟特香301是以高香气和特征香韵品质性状为育种目标,从中烟100甲基磺酸乙酯(EMS)诱变群体中经多年选育而得到的具有特征香韵的烤烟新品种[11],其烤后烟叶香气量足、香气质好,具有明显的花香、青香、蜜甜香以及淡淡的玫瑰花香。徐晓玲等[12]通过气相色谱与质谱联用技术(GC-MS)对中烟特香301和中烟100植株烟芽的挥发性次生代谢产物和初生代谢物进行了检测,共检测到挥发性次生代谢产物27种;检测到初生代谢物60种并进一步筛选到差异初生代谢物27种。但该品种烤后烟叶特征香韵的物质基础尚不清楚。
本研究通过分析中烟特香301和中烟100烤后烟叶的石油醚提取物成分差异,明确中烟特香301石油醚提取物的特定化学成分,为后续揭示中烟特香301香韵风格的物质基础和形成机理提供参考。
供试烟叶选取山东诸城试验基地2020年3个地块平行种植的中烟特香301和中烟100烤后烟叶样品,每地块1 kg,作为3次生物学重复,等级为C3F(中部橘黄三级),其种植和烘烤均按照当地的烤烟生产规范进行。
石油醚(分析纯,沸程30~60 ℃,国药集团化学试剂有限公司);100 mL索氏提取仪(高优环科仪器有限责任公司);FA2004电子天平(精度0.000 1 g,上海精密科学仪器有限公司);RE-2000B型旋转蒸发器(巩义市予华仪器有限责任公司);7890A/5975C气相色谱/质谱联用仪(美国安捷伦科技有限公司)。
1.2.1 样品预处理 样品的制备采用标准YC/T31—1996中试样制备的方法,烤后烟叶样品在烘箱中用40 ℃烘3~4 h直至可用手指碾碎,冷却粉碎后过40目筛,放入真空袋保存备用。
1.2.2 石油醚提取物的提取 石油醚提取率的测定参考标准YC/T 176—2003《烟草及烟草制品石油醚提取物的测定》进行测定,样品的含水率参照标准GB 2635—1992《烤烟》进行测定,提取后的石油醚提取物利用旋转蒸发仪旋蒸浓缩至1 mL,保存备用。
1.2.3 GC-MS条件 色谱柱:DB-5MS石英毛细管(30×250 μm×0.25 μm);载气:高纯氦气,流速1 mL/min;进样口温度:300 ℃;进样方式:分流进样,分流比5:1;升温程序:初始温度50 ℃,保持3 min,先以5 ℃/min升至100 ℃,再以13 ℃/min 升至280 ℃,保持5 min;离子源:EI源;电离电压:70 eV;离子源温度:230 ℃;传输线温度250 ℃;扫描方式:全扫描;扫描范围:33~600 amu。
1.2.4 数据分析 采用NIST MS Search 2.0商业谱库进行检索与未知成分鉴定,采用特征离子峰面积百分比法对鉴定出的挥发性成分进行半定量分析。采用内标法计算烟叶中石油醚提取物成分相对含量,假定校正因子为1。原始数据经标准化处理后,主成分分析(PCA)和偏最小二乘回归分析法(PLS-DA)分析均由SIMCA-P 13.0软件完成;检验由SPSS 26.0软件完成;火山图由TBtools(https://www.tbtools.com/)完成;其余数据处理均由Excel完成。
结果表明(表1),中烟特香301的石油醚提取物得率为8.28%,显著高于中烟100的7.09%。应用GC-MS从中烟100石油醚提取物中鉴定到98种化合物,从中烟特香301中鉴定到到99种化合物;两样品中共有化合物有87种,中烟100中特有化合物有11种,中烟特香301中特有化合物有12种。
按化合物的性质对所得化合物进行分类,共含有烷烃及其衍生物、芳香族化合物、烯类及其衍生物、酸类及其衍生物、酯类、酮类、醛类、醇类、生物碱和其他物质10类,两个样品中每类物质的相对含量见图1。其中,中烟特香301样品中有6大类物质的相对含量均高于对照中烟100,分别是酯类、酸类、醇类、酮类、烯类和醛类化合物。中烟特香301和中烟100样品中上述6种物质的相对含量分别为22.15%和18.99%(酯类)、8.35%和6.89%(酸类及其衍生物)、4.29%和3.97%(醇类)、4.05%和1.86%(酮类)、3.64%和1.83%(烯类及其衍生物)、0.85%和0.40%(醛类)。
表1 中烟特香301和中烟100烤后烟叶石油醚提取物中特有的物质成分
注:“√”代表检出,“—” 代表未检出。CAS号是某种物质(化合物、高分子材料、生物序列、混合物或合金)的唯一的数字识别号码。
Note: "√" means detected,“—” means not detected. CAS number is the unique digital identification number of a substance (compound, polymer material, biological sequence, mixture or alloy).
图1 中烟100和中烟特香301烤后烟叶样品的石油醚提取物类别及占比
从PCA得分图可知,中烟特香301和中烟100分别聚为两类,说明两样品间的石油醚提取物物质成分存在一定差异(图2a)。进一步采用层次聚类(HCA)对结果进行柱状绘图,其结果与PCA得分图一致(图2b),表明中烟特香301和中烟100两样品的石油醚提取物的成分存在明显差异。
2.3.1 PLS-DA的模型建立 PLS-DA分析表明(图3a),模型的2=0.76,2=0.999,2=0.984(2、2和Q是评价PLS-DA模型的3个关键指标。2越接近1,说明模型能代表的样品信息越多;2和2越接近1,说明模型的稳定性和预测性越好),说明两种材料聚类良好,显著分离,且预测性较好。为了验证模型是否存在过拟合现象,进一步采用200次响应排序的方法对模型进行检验(图3b),模型2=0.889,2的截距为−0.16,说明模型有效,不存在过拟合现象。
图2 中烟100和中烟特香301烤后烟叶石油醚提取物的PCA得分图(a)和HCA聚类图(b)
注:a图为PLS-DA得分图,b图为200次交叉验证图。Note: figure a and b are the PLS-DA score diagram and 200 cross validation diagram, respectively.
2.3.2 差异物质成分筛选 根据上述模型,以<0.05和>1.5或<0.5为筛选条件,共筛选得到30种含量差异成分(图4),其中显著上调的化学成分有27个,显著下调的有3个。结合VIP>1的标准(变量权重VIP值越大,说明该成分对两组样本分类判别的影响强度和解释能力越强,通常以VIP>1为筛选标准),最终筛选得到29种化学成分(表2)。
29种含量差异化合物包含6种烷烃、7种不饱和烃、6种酮类、3种酯类、2种醇类,1种氨基酸类、1种醛类和3种其他类物质。在这29种差异石油醚提取物中,中烟特香301有28种化合物的含量高于中烟100,其中酯类物质二氢猕猴桃内酯和五氟辛酸十八烷酯含量分别是中烟100的6.617倍和4.258倍,其余26种组分在中烟特香301中的含量都在中烟100的1.5倍以上。在28种含量差异化合物中有9种化合物具有芳香气味,分别是二氢猕猴桃内酯(6.617倍,香豆素样香气,并有麝香样气息)、巴伦西亚橘烯(1.968倍,柑橘香气)、香叶基芳樟醇(1.577倍,香料定香成分)、巨豆三烯酮(1.953倍,烟草甘甜香气)、榄香烯(1.976倍、茴香气味)、角鲨烯(1.852倍,萜类化合物)、对二甲苯(1.620倍,芳香味)、橙化基丙酮(1.757倍,木兰香气)、顺-11-十六烷烯醛(1.615倍,香精香料类)。
图4 中烟100和中烟特香301烤后烟叶石油醚提取物差异成分的火山图
表2 中烟100和中烟特香301烤后烟叶石油醚提取物组分中含量有差异的成分
注:值表示该物质在中烟特香301与中烟100中的相对含量比值。
Note:value represents the ratio of the relative content of this compound in Zhongyantexiang 301 and Zhongyan 100.
作为以高香气和特征香韵品质性状为育种目标,从中烟100中选育而成的具有花香、青香、玫瑰花香等特征香韵的新品种,中烟特香301香味浓郁、吃味醇和,是极具科研价值的烟草材料,可用于烟草的香韵形成相关研究。烟草的香气成分按官能团分类主要为酯类、酸类、醇类、酮类、烯类、醛类、呋喃类和氮杂环类等[13-14]。中烟特香301和中烟100烟叶石油醚提取物中酯类、酸类、醇类、酮类、烯类和醛类六大类物质的占比各不相同,且在中烟特香301中这几类物质的相对含量高于对照中烟100。这几类物质均是烤烟香气形成的重要成分,其占比的不同可能是导致中烟特香301产生特征香韵的原因之一。另外,中烟特香301中这几大类物质成分占比较大,也从另一个角度解释了中烟特香301香气量足的特点。
石油醚提取物的成分分析表明,中烟特香301检测到12种特有成分,其中包括醋酸橙花苷、3-十八碳烯和5种含氮杂环类化合物。3-十八碳烯可由亚油酸在石油醚提取过程中发生氢化得到,因此推测中烟特香301烟叶中可能会含有一定量的亚油酸,而后者可作为高级脂肪酸的一种,参与烤后烟叶的香型风格形成[15]。氮杂环类化合物的含量也与烟草的香型相关[16],5种特有的含氮杂环类化合物也可能在中烟特香301特征香韵形成中发挥作用。更值得关注的是,中烟特香301样品中检测到一定含量的醋酸橙花苷,而该物质具有橙花和玫瑰样香气,推测是醋酸橙花脂在烘烤过程中和糖类化合物发生反应形成。综上,推测中烟特香301石油醚提取物的一些特有成分可能与该品种烤后烟叶特征香韵的形成(例如淡淡的玫瑰香)存在某些关联。
在两品种烟叶的石油醚提取物差异物质分析中,共筛选得到29种含量相差显著的化合物,28种化合物在特香301的含量是中烟100的1.5倍以上,9种化合物具有香气。这9种化合物中,二氢猕猴桃内酯和巨豆三烯酮均来源于类胡萝卜素降解过程,是烤烟中重要的中性致香成分[17-18]。二氢猕猴桃内酯是烟叶中具有香豆素样香气和麝香样气息的化合物,并且可以抑制其他物质产生的刺激性[19];巨豆三烯酮具有烟草香、花香、木香以及辛香底蕴,作为一种油状液体香气物质天然存在于烟叶中[20-21]。它们在中烟特香301中的含量分别是中烟100的6.617倍和1.953倍,这和曹建敏等[22]的研究结果一致,认为中烟特香301感官评吸时产生的花香香韵,可能与该材料中类胡萝卜素降解产物含量较高有一定的相关性。本研究中筛选得到的其他香气物质也具有花香或果香香调,例如香叶基芳樟醇具有花香和木香香调[13],榄香烯具茴香气味[23],巴伦西亚橘烯具有柑橘香气[24]。上述物质在石油醚提取物中相对含量的大幅度增加,表明这些物质在烤后烟叶中的含量也维持在较高水平,可能是中烟特香301烤后烟叶具有特征香韵、总体感官质量较中烟100明显提升的内在原因。
利用索氏提取的方法获得了中烟特香301和中烟100烤后烟叶的石油醚提取物并通过GC-MS进行测定,进而结合统计学的手段分析了两种石油醚提取物的成分差异。结果表明,中烟特香301和中烟100石油醚提取物中特有的化合物各有12和11种,共有化合物87种;中烟特香301中,酯类、酸类、醇类、酮类、烯类和醛类化合物的相对含量均高于对照中烟100;两个材料中筛选鉴定到二氢猕猴桃内酯、巴伦西亚橘烯、巨豆三烯酮、香叶基芳樟醇等29种含量存在差异的化合物,涵盖酯类、氨基酸类、醇类、酮类、烷烃和不饱和烃等组分。这些数据有助于解析中烟特香301特征香韵的形成原因。
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Analysis of Petroleum Ether Extracts from the Characteristic Fragrant Flue-cured Tobacco Variety Zhongyantexiang301
MO Zhijie1,2, DENG Shuaijun1,2, SHI Sujuan3, MAO Jingjing1, YUAN Jiaping1, WANG Fan4, ZHANG Ge4, CHAO Jiangtao1, CUI Mengmeng1, WANG Qian1*, LIU Guanshan1*
(1. Tobacco Research Institute of CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3. Beijing Workstation of Shanghai Tobacco Group Technology Center, Beijing 101121, China; 4. Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China)
In order to further clarify the material basis of the aroma difference between the special flavor flue-cured tobacco variety Zhongyantexiang301 and Zhongyan100, the petroleum ether extracts of their middle leaves was determined by GC-MS, and principal component analysis (PCA) and partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) were carried out. The results showed that 99 and 98 compounds were identified in the petroleum ether extracts of flue-cured tobacco leaves of Zhongyantexiang301 and Zhongyan100, including 87 common compounds. Zhongyantexiang301 and Zhongyan100 have 12 and 11 unique compounds, respectively. The relative contents of esters, acids, alcohols, ketones, olefins and aldehydes of Zhongyantexiang301 are higher than those of Zhongyan100. Among the common compounds, there are 29 compounds with different contents between them. and the contents of 28 components, such as dihydrokiwifruit lactone, valencia orangeene, geranyl linalool, and megadjatrienone, were significantly higher than those of Zhongyan100.The results provide a reference for revealing the material basis for the formation of the flavor style of Zhongyantexiang301.
Zhongyantexiang 301; petroleum ether extract; flavor; difference analysis
TS41+1
A
1007-5119(2022)03-0071-07
10.13496/j.issn.1007-5119.2022.03.011
中国烟草总公司山东省公司科技重大专项项目(202013,202115);中国烟草总公司湖北省公司科技项目(027Y2020-015);中国烟草总公司云南省公司科技项目(2019530000241038);中国农业科学院基本科研业务费项目(1610232021002)
貊志杰(1997-),男,在读硕士研究生,主要研究方向为烟草品质育种。E-mail:mozhijie11@163.com
,E-mail:王 倩,wangqian01@caas.cn;刘贯山,liuguanshan@caas.cn
2021-11-17
2022-04-20