甘氨酸对脂多糖应激断奶仔猪肠黏膜屏障的调控作用

王 慧，郭俊杰，李先根，任效瑞，刘玉兰，杨彩梅，朱惠玲*

（1.武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 4 300232；2.浙江惠嘉生物科技股份有限公司，浙江安吉 313307）

仔猪断奶应激在规模化、集约化养猪生产中日益成为一个比较严重的问题，给养殖业带来巨大的经济损失。断奶应激激活相关应激信号通路，导致肠黏膜屏障功能受损，继而引起仔猪发生腹泻。甘氨酸（Gly）作为幼龄哺乳动物条件性必需氨基酸，具有抗炎、促进蛋白质合成、抑制氧化应激等功能。研究表明，体外添加Gly 对肠黏膜屏障功能有调控作用。因此，本试验用脂多糖（LPS）诱导仔猪肠黏膜损伤，探究在日粮中添加Gly 对断奶仔猪肠黏膜屏障损伤的保护作用，为养猪生产提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验设计 选用体重相近的（21±1）日龄杜× 长× 大断奶仔猪24 头，平均体重为（7.17±0.17）kg，随机分为4 组，每组6 个重复（栏），每栏1 头猪。4 个处理组分别为对照组（基础日粮）、LPS 组（基础日粮+LPS）、1.0% Gly 组（基础日粮+1.0% Gly+LPS）（L-Gly，有效成分均大于99%，武汉阿米诺科技有限公司）、2.0% Gly 组（基础日粮+2.0% Gly+LPS）。预饲7 d，正试期28 d。在试验第28 天，对照组注射无菌生理盐水，LPS 组、1.0% Gly 组和2.0% Gly 组仔猪腹腔注射LPS（大肠杆菌血清型O55：B5，Sigmaaldrich，美国），剂量为100 μg/kg BW。基础日粮配制参照NRC（2012）仔猪营养需要，按照文献配方配制。各组日粮用丙氨酸进行等氮处理。

1.2 小肠样品采集 试验第28 天，注射LPS 或生理盐水4 h 后，仔猪麻醉、屠宰，取空肠、回肠黏膜标本，置于超低温冰箱-80℃保存。另取空肠和回肠2 cm 用于小肠形态学观察（4%多聚甲醛固定，HE 染色）。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 生长性能测定 在试验开始第1 天和第28 天，空腹12 h 后仔猪称重，记录采食量，计算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和耗料增重比（F/G）。

1.3.2 抗氧化指标测定 按照商品试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书测定空肠、回肠的黏膜谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平。

1.3.3 细菌移位率及移位细菌数测定 无菌采集仔猪的脾脏、肝脏以及肠系膜淋巴结，称取脾脏、肝脏及肠系膜淋巴结约0.1 g，匀浆、接种至鲜血-麦康凯培养基，于37℃细菌培养48 h，菌落计数。培养板上出现菌落定义为细菌移位阳性，计算细菌移位率，细菌移位率=移位组织个数/组织总数×织总数个；菌落计数用于计算移位细菌数，移位细菌数的单位为log（CFU/g）。

1.3.4 小肠组织形态学观察 参照Zhu 等方法测定绒毛高度、隐窝深度，并计算绒毛高度/隐窝深度值。

1.3.5 肠黏膜杯状细胞计数 参照Zhu 等方法计数空肠、回肠杯状细胞数及肠上皮细胞总数，杯状细胞数按公式计算，即杯状细胞数=杯状细胞数/肠上皮细胞总数×100%，取平均值为该组织杯状细胞数。

1.3.6 嗜中性粒细胞、肥大细胞计数 参照Zhu 等方法对空肠、回肠嗜中性粒细胞、肥大细胞计数，并测量视野面积，计算嗜中性粒细胞、肥大细胞密度，细胞密度=细胞数/视野面积，取平均值为该组织嗜中性粒细胞、肥大细胞密度。

1.3.7 小肠黏膜信号通路相关基因mRNA相对表达量的测定 促肾上腺素皮质激素释放激素（）、促肾上腺素皮质激素释放激素受体1（）、促肾上腺素皮质激素释放激素受体2（）、糖皮质激素受体（）、类胰蛋白酶（）等mRNA水平采用Real-time PCR 分析。内参基因为3-磷酸甘油醛脱氢酶（），采用2法计算。Realtime PCR 所需试剂购自大连宝生物工程有限公司，引物由武汉擎科生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 统计分析 数据采用SPSS 10.0 软件进行单因素方差分析和LSD 多重比较，结果以平均值±标准误表示，<0.05 为差异显著，<0.10 为具有显著性趋势。

2 结果

2.1 Gly 对LPS 应激断奶仔猪生长性能的影响 由表2可知，试验第1～28 天各处理组ADG、ADFI 及F/G 没有显著差异。

表2 Gly 对断奶仔猪生产性能的影响

2.2 Gly 对LPS 应激断奶仔猪小肠黏膜MDA 和GSH水平的影响 由图1、2 可知，LPS 应激显著升高回肠MDA 水平（<0.05），降低空肠、回肠GSH 水平（<0.05）；日粮添加1.0% Gly、2.0% Gly 缓解LPS应激导致的回肠MDA 升高（<0.05）及GSH 降低（<0.05）。

图1 Gly 对LPS 应激断奶仔猪小肠黏膜MDA 水平的影响

2.3 Gly 对LPS 应激断奶仔猪小肠形态学的影响 由表3 可知，与对照组相比，LPS 应激使空肠绒毛高度/隐窝深度比值降低（<0.05），且有降低空肠绒毛高度趋势（<0.1）。与LPS 组相比，日粮中添加Gly 对小肠结构没有显著影响。

表3 Gly 对LPS 应激断奶仔猪小肠形态学的影响

2.4 Gly 对LPS 应激断奶仔猪细菌移位率及移位细菌数的影响 由表4、5 可知，与对照组相比，LPS 应激增加细菌移位率；与LPS 组相比，日粮添加Gly 降低细菌移位率，但差异均不显著。与对照组相比，LPS 应激增加脾脏移位细菌数（<0.05），且有增加肝脏移位细菌数的趋势（<0.1）；与LPS 组相比，2.0% Gly 组肝脏移位细菌数显著降低。

表4 Gly 对LPS 应激断奶仔猪细菌移位率的影响

图2 Gly 对LPS 应激断奶仔猪小肠黏膜GSH 水平的影响

2.5 Gly 对LPS 应激断奶仔猪小肠黏膜免疫细胞的影响 由表6 可知，与对照组相比，LPS 应激增加断奶仔猪回肠肥大细胞密度（<0.05），且有增加空肠杯状细胞数的趋势（<0.1）；与LPS 组相比，日粮添加1.0% Gly 降低空肠肥大细胞数及回肠嗜中性粒细胞密度（<0.05），且有降低回肠肥大细胞密度的趋势（<0.1）；而日粮添加2.0% Gly 有降低空肠嗜中性粒细胞密度的趋势（<0.1）。

表5 Gly 对LPS 应激断奶仔猪移位细菌数的影响 log10（CFU/g）

表6 Gly 对LPS 应激断奶仔猪小肠黏膜免疫细胞影响

2.6 Gly 对LPS 应激断奶仔猪小肠黏膜信号通路相关基因mRNA 相对表达量的影响 由表7 可知，与对照组相比，LPS 应激增加空肠（<0.05）、（<0.001）和（<0.05）及回肠（<0.001）的mRNA 相对表达量。与LPS 组相比，1.0%Gly 组空肠及回肠mRNA 相对表达量显著降低，2.0% Gly 组空肠及回肠mRNA 相对表达量显著降低。

表7 Gly 对LPS 应激断奶仔猪小肠黏膜CRF/CRFR1信号通路相关基因表达的影响

3 讨论

Gly 是体内最简单的氨基酸，它不仅参与蛋白质、嘌呤等合成，其在氧化损伤修复、免疫调节等方面也发挥重要作用。Gly 对动物肠黏膜屏障功能有一定的改善作用。本试验用LPS 诱导仔猪肠黏膜损伤，探究Gly对断奶仔猪肠黏膜屏障损伤的保护作用。

体内外试验发现，LPS 应激可使机体自由基（如活性氧）生成增多，抗氧化能力下降，最终导致氧化应激。MDA 水平反映组织氧化应激的损伤程度，GSH 是评价机体抗氧化能力的指标。在氧化应激状态下，仔猪小肠黏膜MDA 含量升高。刘静波等研究发现断奶应激降低仔猪小肠黏膜GSH 含量。本研究表明，LPS应激导致小肠黏膜MDA 水平升高，GSH 水平降低，提示LPS 诱导仔猪氧化应激；日粮中添加1% 或2% Gly显著降低了MDA 水平和增加GSH 水平，说明Gly 缓解了LPS 导致的氧化应激。同样，Wang 等研究发现，Gly 可以抑制猪肠上皮细胞氧化应激，维持肠道健康。Gly 是内源性GSH 合成的底物，日粮添加Gly 可以促进谷胱甘肽合成，提高肠道抗氧化能力。此外，Gly 可以转化为丝氨酸发挥抗氧化作用，继而维持肠道稳态。

氧化应激可导致肠黏膜屏障功能障碍。本研究发现，LPS 应激会使肠绒毛呈现不同程度脱落，绒毛高度及绒毛高度与隐窝深度比值降低，肠黏膜形态结构受损，这与Zhu 等发现一致。肠黏膜结构受损会导致肠黏膜通透性增加，肠腔细菌及其产物转移到肠系膜淋巴结和更远的部位即细菌移位。细菌移位是评价肠黏膜屏障功能的重要指标。本研究中，LPS 应激增加脾脏、肝脏移位细菌数，而日粮中添加2% Gly 可使肝脏移位细菌数降低，肠黏膜屏障结构和功能改善。Li 等对近交猪自体小肠移植发现，Gly-Gln 二肽可显著减少肝、脾及肠系膜淋巴结细菌数，降低肠道通透性。Gly可为细胞合成嘌呤和嘧啶提供一碳单位，从而促进肠黏膜细胞的更新及损伤修复。此外，Gly 缓解了LPS 应激导致的炎性细胞（嗜中性粒细胞）浸润，这可能与Gly的免疫调节功能有关。

应激导致肠黏膜屏障功能障碍机理还不甚清楚，一般认为与CRF 及其受体CRFR1 信号通路激活有关。CRF 是一种由41 个氨基酸组成的下丘脑肽，是应激和免疫/ 炎症反应的主要调节因子。CRF 的受体包括CRFR1 和CRFR2，CRFR2 参与肠黏膜损伤的修复，而CRFR1 则与CRF 结合激活肥大细胞。Smith 等研究表明，CRF 通过激活肥大细胞释放类胰蛋白酶诱导肠上皮屏障损伤。肥大细胞是一种造血来源的免疫细胞，可迁移到外周组织成熟并调节多种效应功能。此外，CRF也可以促进皮质醇释放，皮质醇与肠黏膜糖皮质激素受体（GR）结合导致肠黏膜屏障功能障碍。本研究表明，LPS 应激增加了空肠、回肠和相对mRNA 的表达及肥大细胞密度，说明LPS 激活了CRF/CRFR1 信号通路；日粮中添加1% Gly 通过降低空肠、回肠和mRNA 的水平及肥大细胞密度来保护肠黏膜免受LPS 应激损伤。Gly 对CRF/CRFR1 信号通路的影响未见报道。Ruiz-Ramírez 等研究发现，Gly 可以缓解大鼠氧化应激，保护血管组织。本试验说明Gly 可能通过调节CRF/CRFR1 信号通路缓解LPS 应激导致的肠黏膜损伤，从而保护肠黏膜屏障功能的完整性。

4 结论

本试验结果显示，断奶仔猪日粮添加1% Gly 可以缓解LPS 应激导致的CRF/CRFR1 信号通路相关基因的过量表达，降低细菌移位率及移位细菌数，提高肠道抗氧化能力，维持肠黏膜屏障功能的完整性。