体外受精和胚胎移植技术在肉牛双胎生产中的应用研究进展

王志成，苏昶祺，陈仕毅，贾先波，王 杰，张 明

（四川农业大学动物科技学院，四川成都 611130）

2020 年我国肉牛屠宰2 920 万头，肉牛总产值达到5 540 亿元。母牛终生自然繁殖只能产生7～8 个后代，肉牛繁殖率低已经成为制约我国肉牛产业发展的重要因素。利用动物繁殖生物技术使母牛进行双胎生产是提高母牛繁殖率的有效手段。

体外受精-胚胎移植（IVF-ET）是指通过卵母细胞体外成熟（IVM）、体外受精、经过早期胚胎发育获得体外胚胎，并将胚胎移植到受体体内的过程。近年来，通过IVF-ET 方案可以获得50%的妊娠率，有利于改善肉牛繁殖率，加速肉牛遗传改良，该方案在北美洲肉牛生产中受到欢迎。随着尼罗牛、瘤牛等肉牛品种卵母细胞品质提高以及体外受精胚胎（IVP）全产业链的完善，在南美洲IVF-ET 技术已广泛应用于商业化生产。日本采用胚胎分割或者囊胚分离技术分裂IVF 胚胎，生产同卵双胚，应用于日本和牛双胎生产，双犊率可达到20%。另外，胚胎冷冻和性控精液技术的不断优化和发展推动了IVF-ET 技术产业化应用进程，提高了肉牛生产效益，但其稳定性差、操作难度大、产业链不健全是限制IVF-ET 技术在我国产业化应用的重要原因。本文对国内外IVF-ET 操作及双胎生产进行技术总结，对该技术产业化应用研究进展和存在问题进行概述与分析，旨在为该技术在我国的产业化应用提供参考。

1 IVF 胚胎生产过程与现状

1.1 卵母细胞收集 近年来，活体采卵-体外受精（OPU-IVF）技术在我国产业化应用中得到进一步优化，综合繁殖生物技术的应用使规模化牛场的繁殖成活率提高4%，OPU 技术成为母牛活体获得高质量卵母细胞的重要途径。OPU 技术可以每周重复采卵2 次，甚至可从幼年母牛或者妊娠3 个月内的母牛卵巢上采集品质较好的卵母细胞，不影响母牛卵泡波形成和繁殖水平。Trans Ova Genetics 和L'Alliance Boviteq 公司把OPU技术商业化应用于优良母牛的快速繁殖，但生产成本高、妊娠率相对较低等制约了该技术在我国肉牛产业中的应用。同时OPU 获得的85%以上卵母细胞处于凋亡闭锁过程，卵母细胞品质难以保证。随着我国肉牛集约化屠宰水平的提高，在屠宰场规模化收集卵巢处理后，可获得较多卵母细胞。屠宰母牛通常繁殖机能低，自然情况下获取有腔卵泡中卵母细胞的数量少、质量低。因此，屠宰前对母牛进行超排处理是提高卵母细胞品质重要的发展方向。目前，屠宰场收集卵母细胞仍是最便捷、廉价的牛卵母细胞收集方式，同时OPU 技术是未来获得高质量卵母细胞的重要发展方向。

1.2 卵母细胞IVM 培养及优化 OPU 和屠宰厂获得的卵母细胞绝大多数为未成熟卵母细胞，需在体外培养20～26 h 才能发育至成熟卵母细胞。卵母细胞IVM 与体内成熟相比，线粒体、内质网、染色体和纺锤体等结构和功能可能出现异常。活性氧可能损伤细胞核DNA 和细胞膜，从而导致卵母细胞处于氧化应激状态，使胚胎发育能力下降。添加外源性激素、抗氧化物或者与卵丘细胞、间充质干细胞和裸卵建立共培养体系是提高卵母细胞成熟率，改善胚胎品质的重要方式（表1）。

表1 不同添加物对牛COCs 体外成熟培养液优化效果

随着研究不断深入，不同的方案应用于卵母细胞IVM 以改善卵母细胞成熟率，促进IVF-ET 技术的产业化进程。采卵前超数排卵后再进行卵母细胞体外受精发育，囊胚率可到70% 以上，推测卵母细胞成熟率达到80% 以 上。Li 等、Albuz 等在IVM 之前用减数分裂抑制剂进行预处理（SPOM 方案），卵母细胞成熟率可达到80%～90%。有研究表明，减数分裂抑制剂的应用也有助于95～115 μm 较小卵子母源mRNA和蛋白质积累，进一步促进胞质成熟，提高体外胚胎品质。新型的SMM（转运与成熟培养基）培养效果显著优于传统TCM199 培养基。由于SMM 不需要5% CO，因此应用于商业生产更加方便。如果以达到MII 期评估有腔卵泡中卵母细胞成熟率，牛卵母细胞IVM 体系已经非常成熟，但要改善卵母细胞IVM 后早期胚胎发育，仍有大量的工作需要开展。另外，卵巢上大量无腔卵泡卵母细胞资源仍然无法利用,无腔卵泡中卵母细胞的研究将显著提高可利用卵母细胞数目。因此，建立无腔卵泡中卵母细胞高效收集利用方法将提高胚胎生产效率和经济价值。

1.3 受精效率 IVM 后的卵母细胞转移入TALP 液，与获能精子进行精卵孵育，受精率可达70%～85%。精子品质是制约体外受精的重要的因素，添加Ca、HCO和肝素可以显著提高精子获能率和受精效果。Swim-up 或Percoll 方法处理精子常被用来改善精子活力和质量。透明带打孔技术（PZD）、透明带下注射技术（SUZI）和单精子胞浆内注射（ICSI）以及微流控技术的发展有效提高了单精子、弱精子穿越透明带的能力，促进精卵融合和胚胎发育。

另外，性控精液技术商业化应用也将进一步提高家畜的繁殖效率。流式细胞分选方法进行精子性控是生产指定性别胚胎，改善胚胎品质的重要手段。与传统的性控冻精方法相比，精子分选技术可实现精子冻-解、分选和二次冻-解过程，很好地解决冻精到分选地的远距离运输问题，该技术的应用有效推动了性控冻精的商业化应用。

ICSI 能够实现性控精子进入卵母细胞，生产指定性别胚胎，该技术广泛应用于良种繁育或性控精液体外受精。除此之外，IVF 和人工授精（AI）技术也常用于指定性别胚胎生产（表2）。采用IVF 方式进行指定性别胚胎生产的稳定性差，可能与卵母细胞品质和精卵孵育环境差异有关。通过ICSI 或者AI 技术生产指定性别胚胎，进行同性别双犊生产，可有效避免自由马丁现象，对提高肉牛或奶牛繁殖效率具有重要意义（图1）。

图1 利用XY 精子分选技术进行IVFET 和AI+ET 双胎生产技术流程

表2 ICSI、IVF 和AI 技术进行指定性别牛生产情况

自2005 年精子分选技术发展以来，南美洲奶牛体外胚胎生产数量超过肉牛。Pontes 等进行OPU-性别控制胚胎商业化生产跨长距离运输进行移植，妊娠率可达36%～40%。目前，采用性控精液技术可实现90%的指定性别胚胎生产，满足母牛繁育、公牛屠宰的市场需求，增加每枚胚胎的经济价值，但利用性控精子进行胚胎生产的操作难度大、生产成本高、稳定性差。随着技术发展，性控精子仍是增加母牛可控后代重要的生物技术手段，该技术应用于IVF 和AI 实践生产将显著改善经济效益。

1.4 早期胚胎培养 牛早期胚胎发育至8～16 细胞期会出现发育阻滞现象，合子从输卵管向子宫移动的过程中，所处环境不断发生变化。在与受精卵体外共培养的过程中，输卵管上皮细胞正在去分化并且基因组表达谱不断变化。体外受精胚胎抗冻性、超微结构（微绒毛和脂滴数量）、基因表达和染色体结构与体内来源胚胎存在较大差异。因此，IVF 胚胎发育能力、母牛的妊娠率及产犊率相对较低。

外源性添加生长因子和细胞因子或者与体细胞共培养模拟输卵管液，能够克服发育阻滞，改善早期胚胎发育（表3）。胎牛血清（FBS）中包含多种细胞自身维持和增殖所需的物质，被广泛应用于卵母细胞IVF 和早期胚胎培养过程中。但是FBS 的使用可能增加疫病传播和大胎综合征的风险，导致胚胎抗冻性下降。Hamdi 等将低浓度输卵管液和子宫液与合子共培养后，囊胚率提高30% 以上，抗氧化能力增强。因此，低浓度输卵管液和子宫液共培养方案可能提供一种无血清培养替代方案。

表3 不同添加物对牛体外早期胚胎培养液优化效果

目前常用的胚胎培养方案有一步培养法和两步培养法，一步培养法内源性生长因子积累多、环境应激小。两步培养法毒性物质积累少，可以及时添加细胞生长所需物质，但相应生产成本也会上升。下一代的胚胎培养可能会集中探索微流控技术在胚胎培养上的应用，采用该技术的优点在于可以实时添加胚胎发育所需物质，避免细胞的pH 和温度变化，减少毒性物质积累。探索新方法改善IVP 胚胎的发育潜力是未来将IVF-ET技术应用产业发展的重要研究方向。

1.5 胚胎冷冻保存 囊胚形成后可以进行新鲜胚胎移植，需要同期化处理使受体母牛同时达到受孕状态。采用胚胎冷冻保存可有效提高生产效率，实现远距离胚胎运输和适时移植，减少疫病传播风险。

玻璃化冷冻胚胎解冻后存活率和移植成活率较高，不需要特殊设备就可实现。但玻璃化冷冻胚胎需要经过解冻、复苏和脱抗冻剂后才能移植，而且需要操作者具备长期的经验积累才能熟练完成。因此，该方法应用胚胎商业化具有局限性。

程序化冷冻又称为慢速冷冻，是细胞外水结晶，产生渗透梯度，胞质脱水浓缩过程。程序化冷冻成功的关键在于平衡水结晶和细胞脱水时间，避免冰晶形成破坏细胞膜和细胞器结构。程序化冷冻法冰晶形成会损伤细胞结构且需要专门仪器，但是使用较小浓度抗冻剂对细胞毒性小、而且可以直接移植，适合规模化胚胎生产使用。最近，Sanches 等研究表明将性控胚胎采用程序化冷冻进行胚胎移植可以达到与玻璃化冷冻相同的妊娠效果。在冷冻过程中添加犊牛血清（FCS）脂溶性物质降低胚胎中脂含量以提高胚胎的抗冻性。牛血清采集成本较高，同时可能对胚胎细胞造成不可逆的损害。因此，无血清抗冻保护液开发是商业化生产的主要方向。

当前，冷冻液中添加1.5 mol/L 乙二醇配合蔗糖在胚胎冷冻中广泛使用，用1.5 mol/L 甘油配合0.25 mol/L蔗糖做冷冻液来进行直接移植可获得良好的效果。有研究表明，程序化冷冻囊胚、玻璃化冷冻桑葚胚胎可能获得较好的生产效果。为满足胚胎解冻后直接移植进行商业化生产，程序化冷冻是适应生产实践的冷冻胚胎方法，但是冷冻液中添加促进冷冻胚胎着床和发育的物质，增加冻胚存活率和着床率仍然有很大提升空间。

2 IVF-ET 技术应用于牛双犊生产现状

近年来全球体外生产胚胎数量呈上升趋势，特别是在美洲和欧洲地区（图2）。经过近50 年的不断探索，IVF 技术应用于生产实践囊胚率为30%～40%。因此，IVF 胚胎商业化应用仍需进一步提高胚胎品质。目前，我国肉牛胚胎工程应用产业化还处于起步阶段，存在实践水平低、生产规模小、商业化运行机制不健全等短板，但整体市场需求和发展潜力巨大。采用IVF-ET 技术进行双胎产业化生产将提高能繁母牛的经济效益，进一步满足市场对肉牛需求。

图2 2013—2018 年全球收集胚胎和胚胎移植数量变化趋势

当前，双胎生产可使肉牛生产效益增加20%～25%。诱导双胎、ET 和AI-ET 技术等繁殖生物技术是生产双胎的有效手段（表4）。诱导双胎技术易于操作，不需要昂贵的设施，但易受个体和环境因素影响，整体双胎生产效果不佳。母牛AI 后子宫进入妊娠环境，再进行ET 可以获得较好的双胎生产效果，该技术也是解决母牛重复配种未孕的重要手段。2001 年，爱尔兰Ovamass Ltd 公司报道将AI+ET 技术应用于商业化生产中双犊率可达34%。但该技术难度大，难以应用于商业化生产。目前，胚胎来源主要分为体内来源和体外受精2 种方式（图3），综合生产成本和移植后的妊娠率考量，IVF-ET 技术作为高效廉价的双犊生产策略应用于肉牛生产将提高母牛繁殖率，犊牛生产的新增加收益达到4 500～5 500 元/头。另外，同期化方案在国内外的规模化肉牛养殖场应用广泛，研究表明同期化处理会诱导母牛生产双胎，也将提高胚胎数量以及移植成功率。若结合同期发情进行批次化双胎生产，可以显著提高生产效率。

表4 诱导双犊、IVF-ET 和AI-ET 技术应用于肉牛双胎的妊娠率和双犊率

图3 IVD/IVF 胚胎生产过程

能繁母牛双胎生产也存在着较多需要解决的问题，动物自身及环境等多种因素可能都会影响母牛超数排卵效果，激素水平和移植位置也有可能影响肉牛双胎生产。另外，根据美国MARC 相关数据，奶牛双胎造成的产科问题严重影响奶牛的生产性能。每年奶牛双胎对美国奶牛产业造成大约9 600 万美元的损失。因此，双胎生产技术应用于产业化发展，应当权衡经济效益。在自然资源相对不足国家，利用胚胎移植进行肉牛双犊生产仍是未来提高牛肉产量重要的生产手段。

3 展望

IVF-ET 技术已广泛应用于肉牛品种改良和良种繁育。该技术应用于肉牛双胎规模化生产，将会提高母牛繁殖效率，加快肉牛规模化养殖的步伐，提高肉牛养殖经济效益。IVF 技术在我国肉牛产业化应用中取得较快发展，但我国IVF-ET 技术应用于商业化双胎存在生产成本较高、配套产品不足以满足大规模IVF 胚胎生产等问题，且能胜任胚胎标准操作的技术人员少，存在成本与收益问题尚需进一步通过优化方案来解决。但IVFET 技术仍然是目前最可行、最现实和最有发展前景的肉牛双胎生产技术。