NRP1和TGF-β1在涎腺腺样囊性癌组织中的表达与意义

杨永超，安 峰，王钟华

(河北北方学院附属第一医院 口腔科，河北 张家口 075000)

涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)是口腔颌面部涎腺中常见的一种恶性肿瘤，恶性程度及发生率均较高，其发病率仅低于黏液表皮样癌，肿瘤的发病部位最常见的是上腭部的小涎腺，其次是腮腺和下颌下腺；临床上如发现舌下腺肿瘤发生恶变，应首先考虑为SACC。SACC具有两个显著的肿瘤生物学特征：①血行转移高而淋巴结转移低；②神经侵袭率极高。相关报道SACC的血行转移率高达40%，肺部是SACC血行转移最主要的目标器官；临床上发现SACC的颈部淋巴结转移率较低[1]。对于SACC患者而言，其血行转移、神经侵犯的生物学特征对癌症患者的功能保留及远期预后极为不利。国内外大量学者一直从相关基因、血管生成方向致力于SACC生物学特征的研究。

NRP1是Neuropilin蛋白家族中的重要成员之一，是一种调控胚胎组织发育以及肿瘤进展的跨膜糖蛋白，研究发现NRP1被上调时，可调节肿瘤微环境，并以此促进肿瘤细胞不断进行有丝分裂，具有刺激肿瘤不断生长并发生浸润，促进周围血管生成等生物学特征。TGF-β1(transforming growth factor β1)是转化生长因子β家族中重要成员之一，在上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、肿瘤细胞转移浸润和逃避免疫控制过程中通过多种信号通路发挥重要作用。本研究应用免疫组化SABC技术检测NRP1和TGF-β1在SACC组织中、涎腺正常组织中的表达水平，分析两者与SACC之间的关系，并研究两者之间是否存在相关性，探寻其在SACC发生发展中可能存在的机制。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 实验组的标本采集 收集2013年6月～2020年12月于河北北方学院附属第一医院住院行手术切除治疗的51例患者的标本蜡块。所有标本术后均经常规病理诊断为SACC。所收集病例的临床资料详实且术前3个月内未接受相关抗癌治疗(放射、化学、靶向治疗等)。对标本按照性别、年龄(38～75岁，中位年龄55岁)、组织学(2005年制定的病理学分类标准)、临床分期(AJCC唾液腺癌TNM分类分期，2017)、颈淋巴结情况、神经系统情况进行分类，其中：男27例，女24例；年龄≤55岁26例，>55岁25例；管状/筛孔型30例，实性型21例；Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ～Ⅳ期27例；侵犯颈淋巴结14例，未侵犯颈淋巴结37例；侵犯周围神经22例，未侵犯周围神经29例。

1.1.2 对照组的标本采集 取手术中切除的20例涎腺正常组织作为本实验的对照标本。

1.2 试剂 兔抗人NRP1亲和抗体(武汉青木生物技术有限公司)，兔抗人TGF-β1亲和抗体(上海雅吉科技有限公司)，SABC检测试剂盒、DAB试剂(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 免疫组化 所有组织标本均以4 μm的标准厚度，制作出实验切片。实验切片先进行脱蜡至水，然后热修复法行抗原修复：放入枸橼酸盐缓冲液中加热。修复完成后用PBS缓冲液冲洗5 min，共2次。一抗NRP1(1∶200)、TGF-β1(1∶100)，SABC法染色，苏木精复染、脱水封片。

1.4 结果判定 根据免疫反应评分法[2](immunreaktiven score，IRS)对本次实验结果进行综合评分。首先统计每张染色切片中阳性细胞的个数及总细胞数，计算其阳性率(以PP表示，数据采用百分制)；然后依据细胞颜色判断实验切片中细胞的染色强度(以SI表示)，两者相乘计算出最终得分(IRS=PP×SI)。用200倍的高倍镜头在每个实验切片中任意选取10个不连续视野，计算出阳性细胞百分比，多次实验取平均值：无阳性细胞PP计0分，03表示高表达，≤3表示低表达。

1.5 统计学方法 采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。NRP1、TGF-β1在各组别间的表达采用χ2检验，NRP1、TGF-β1间关联性采用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NRP1、TGF-β1在SACC及涎腺正常组织中的表达 NRP1、TGF-β1在SACC及涎腺正常组织的阳性表达产物主要集中于细胞的胞质和胞膜中。见图1。

A.NRP1；B.TGF-β1。

2.2 NRP1、TGF-β1在SACC组织中的表达情况及与临床病理因素之间的关联 SACC组织中NRP1、TGF-β1的阳性细胞表达率高于涎腺正常组织，差异均有统计学意义(P<0.05)。NRP1、TGF-β1在SACC组织中的表达水平与患者性别、年龄相关性无统计学意义(P>0.05)；与肿瘤的组织学类型、临床分期、肿瘤细胞是否侵犯到颈部淋巴结以及是否侵犯到周围神经有关(P<0.05)。见表1。

表1 SACC组织及涎腺正常组织中NRP1、TGF-β1的表达情况及与临床病理因素之间的关联[n(%)]

2.3 SACC组织中NRP1和TGF-β1关联性 结果显示，NRP1和TGF-β1在SACC组织中的表达呈正相关(P<0.05)，见表2。

表2 NRP1、TGF-β1在SACC中的表达关系

3 讨论

NRP1是神经纤毛蛋白同源物中的一种多功能跨膜蛋白，研究发现，NRP1对神经元和心血管系统的发育至关重要。NRP1在癌症中可与血管相关因子作用，可与血管内皮生长因子A直接作用形成复合物VEGFA，进而促进肿瘤细胞的生长和侵袭，促使肿瘤恶化[3]；还可与血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)作用，增强肿瘤增殖区域的血管生成。在口腔癌症中，沈耀川等[4]使用两种方法证实抑制NRP1功能后，舌癌TCaSll3细胞的增殖能力均显著降低，而凋亡率则显著增加。本研究发现NRP1在SACC组织内的阳性率(62.7%)高于口腔涎腺正常组织(35.0%)，差异有统计学意义(P<0.05)，提示NRP1可能促进SACC的发生。在SACC中NRP1与年龄、性别相关性均无统计学意义(P>0.05)。在本实验中我们可以发现，NRP1与组织学类型、临床分期、有无颈淋巴结转移以及有无神经侵犯均相关(P<0.05)，提示SACC中的NRP1可能促进了肿瘤的恶化程度。

TGF-β1是TGF-β超家族中重要的亚型，在人体发育、病变过程中广泛地参与许多生物过程，主要作用包含调节各个阶段的胚层生长发育；促进细胞外基质合成、上皮组织细胞分裂增长；改变机体免疫应答等[5]。研究发现在肿瘤的恶变、侵袭机制中TGF-β1发挥着截然不同的两种作用：在肿瘤早期形成阶段，TGF-β1可作为肿瘤生长的抑制因子，遏制癌前上皮细胞的有丝分裂，减小增殖；随着肿瘤细胞数量的逐渐增长，肿瘤细胞的细胞遗传和DNA甲基化也随之发生改变，TGF-β1逐渐失去对肿瘤细胞的抑制作用，当抑制作用无法抵制肿瘤细胞增长时，肿瘤细胞进入优势生长阶段；在肿瘤的最后阶段，TGF-β1反而可通过多种信号传导，促使病变细胞发生从上皮状态向间质状态转换，可使肿瘤组织的病变细胞转移速度加快，周围血管内皮细胞激活、增殖等，为肿瘤增殖、浸润及转移提供有利的生长环境，最终TGF-β1变成肿瘤癌变过程中的促进因子。本研究表明，TGF-β1在SACC组织内的阳性率(58.8%)高于口腔涎腺正常组织(30.0%)，差异有统计学意义(P<0.05)，提示TGF-β1与SACC的发生相关。本次研究我们在SACC中还发现，TGF-β1与年龄、性别相关性无统计学意义(P>0.05)；与组织学类型、临床分期、有无颈淋巴结转移以及有无神经侵犯均相关(P<0.05)，表明TGF-β1与SACC的恶化、转移密切相关，提示其可作为判断病情进展的依据。

综合本实验SACC组织中NRP1和TGF-β1的表达关系发现：两者在SACC组织中的表达呈正相关。有研究认为：在肿瘤细胞获得侵袭及转移的生物过程中，当肿瘤细胞的连接与极性丧失，获得高迁移能力时，肿瘤开始发生EMT；然而在EMT过程中，TGF-β1被认为是最有效的协调因子之一；NRP1是一种多功能的共受体，具有结合不同蛋白家族的能力，在EMT过程中NRP1可调节其相关的信号通路。因此，推测NRP1可结合并激活潜在形式的TGF-β1，可作为TGF-β1的受体，在多种细胞中已被证明NRP1增强TGF-β1的诱导反应能力[6]。另有研究发现：TGF-β1在肿瘤快速增殖过程中，通过多种信号传导促进肿瘤增殖区域的血管形成，因此相关学者关注到TGF-β1与血管内皮生长因子(VEGF)有着密切的联系[7]。目前认为VEGF是一种促进血管快速生长的因子，能够刺激血管内皮细胞增殖、形成新生血管。当VEGF在肿瘤组织中表达活跃时，血管通透性增强，导致肿瘤细胞向远处组织侵袭、转移[8]。已发现TGF-β1能促进VEGF的表达[9]；

而血管内皮细胞中可以检测到NRP1的表达，NRP1结合VEGFA，可促进血管生成[10]，由此研究推测，NRP1可与TGF-β1相互作用，促进肿瘤的高血行转移率。最终我们可以推测得出NRP1可能通过一种或者多种路径与TGF-β1共同作用，本研究结果也证实此推测，在SACC组织中NRP1可能与TGF-β1共同作用，促进肿瘤血管形成，加速了肿瘤的发展。本实验在SACC中研究两者的关系可为指导肿瘤的预后、治疗提供相关依据。