顶花胡椒石油醚萃取物化学成分及抗菌活性研究

田波，徐文晖，孟伟，3

1.贵州林业勘察设计有限公司，贵州贵阳 550000；

2.西南林业大学，云南昆明 650000；

3.贵州省林业调查规划院，贵州贵阳 550000

顶花胡椒（Piper terminaliflorum）为胡椒科胡椒属攀援灌木[1-3]，对胡椒属植物化学研究表明，吡啶、哌啶和马兜铃内酰胺等类生物碱，木脂素及挥发油为本属的主要成分，此外，还发现多种黄酮类化合物[4-8]。国内外对数十种胡椒属植物的化学成分和药理作用作了大量的研究，分离了多种化合物，并发现该属植物具有抗血小板活性、抗炎活性、镇痛和镇静作用、抗感染活性、抗氧化活性、抗肿瘤作用及其他药理活性[9-13]。胡椒属植物及化学成分还具有降血糖、降血脂、抗疲劳、紫外线防护等多种药理作用。

胡椒属植物具有复杂的化学成分和广泛的药理作用，已有的研究结果提示胡椒属植物在临床上的应用还比较局限，这和中国有丰富的胡椒属植物资源以及该属植物广泛的药理活性不相符。对胡椒属植物的有效化学成分筛选，已取得了许多进展，分离得到并合成了许多有效的化合物，但胡椒属植物的化学成分的分离和药理作用研究还远未结束，对其进一步的研究也必将会有更多结构新颖、活性强、机理独特的新型药物被发现和开发。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂及仪器

1.1.1 实验材料

顶花胡椒全草于2020 年7 月采自云南临沧，经西南林业大学植物教研室鉴定为胡椒科胡椒属植物顶花胡椒。

1.1.2 实验试剂

石油醚、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、乙醇、甲醇（以上均为分析纯）；蒸馏水；显色剂：10%H2SO4；200～300目正相硅胶。

1.1.3 实验仪器

核磁共振仪、电热恒温鼓风干燥箱、紫外分析仪、数显恒温水浴锅、旋转蒸发仪、高效液相色谱仪、真空抽滤机、分析天平；剪刀、一次性手套、粉碎机、布氏漏斗、抽滤瓶、分液漏斗、圆底烧瓶、常压玻璃色谱柱、TLC 板、展开槽、三角瓶、玻璃棒、烧杯、磨口玻璃瓶、移液枪、洗耳球、玻璃毛细管、量筒、漏斗、胶头滴管、滤纸、脱脂棉、铝箔纸。

1.1.4 供试病原菌

供试病原真菌：西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp．niveum），大豆炭疽病菌（Colletotrichum glycines）。

供试病原细菌：番茄青枯病菌（Ralstonia solanaceance）。

1.2 顶花胡椒的分离纯化

1.2.1 顶花胡椒浸膏的制备

将顶花胡椒样品阴干，粉碎，得到顶花胡椒粉末11kg，用浓度为95%乙醇室温浸提3 次，每次3d，过滤浸提液，将过滤后的浸提液用旋转蒸发仪减压浓缩，得到顶花胡椒浸膏3.5L。

1.2.2 乙酸乙酯、石油醚萃取物的提取

将3.5L 顶花胡椒的浸膏和适量蒸馏水加入分液漏斗中，然后分别加入石油醚和乙酸乙酯进行萃取，将得到的萃取物减压浓缩蒸干，最终得到石油醚萃取物303.6g，乙酸乙酯萃取物145.9g。

1.2.3 顶花胡椒石油醚萃取物的柱色谱分离

（1）拌样：将303.6g 顶花胡椒石油醚萃取物用适量氯仿溶解后加入到290g 硅胶中，用玻璃棒搅拌，使样品充分吸附在硅胶上；然后将其倒在大小合适的托盘上，铺平；待溶剂完全挥发以后，将拌好的样品置于研钵中研磨至没有明显的结块。

（2）装柱：为湿法装柱。将色谱柱固定在铁架台上，与地面垂直并且与铁架台水平，在柱子底部放置适量的棉花，打开活塞开关，并在柱子正下方放置一个大烧杯；称取1130g 硅胶置于洁净干燥的烧杯中，加入适量石油醚，使硅胶充分湿润，用玻璃棒搅拌混匀，可将烧杯用超声仪器做超声震动处理，帮助硅胶中气泡的排出，然后缓慢加入色谱柱中；待硅胶完全沉淀、溶剂液面稍高于硅胶表面时，关闭活塞开关。

（3）上样：采用干法上样。将拌样完成的样品缓慢均匀的加入在上述硅胶上，加的过程中可用洗耳球轻敲柱子，使样品能够分布均匀且有助于气泡的排出；然后用石油醚冲洗粘在色谱柱壁上的样品，尽量不要破坏硅胶面的平整；打开活塞开关，使溶剂流出，在溶液表面接近样品硅胶面时，在加入石油醚，这样少量加入，重复2～3 次。

（4）梯度洗脱：分别用石油醚：甲醇[200∶1（4000ml）、100∶1（4550ml）、50∶1（4000ml）、20∶1（6960ml）、10∶1（6070ml）、5∶1（12495ml）、3∶1（7370ml）]进行梯度洗脱，用按顺序编号的100ml 锥形瓶接样，然后用旋转蒸发仪减压浓缩后转移到同样顺序编号的小玻璃瓶中。

（5）薄层层析检测：根据需要点样的样品个数取大小适宜的薄层板，在其一端约1.5cm 处用铅笔划线，每隔1cm 左右用铅笔稍作记号，并写下需要进行点样的样品编号；选择合适的有机溶剂将样品溶解至适宜的浓度，用毛细管吸取样品后点于薄层板上相应的位置，点应为圆点，直径2mm～4mm，点样时要注意勿损伤薄层表面。

点样完成后，将配好的展开剂倒入展开缸内，盖上盖子并摇晃展开缸，以确保展开剂充分混合。把点样完成的薄层板放入展开缸内，展开剂不能淹没点样的样品，待展开至一定的距离（薄层板顶端需留出部分空余便于写展开条件），取出薄层板，轻划出展开剂扩散的边缘；展开剂挥发后，用紫外分析仪245nm 和365nm 波长观察，用铅笔划出可见的荧光斑点；然后用10%H2SO4-Ethanol 将薄层板染色，再用热风筒烘烤至出现紫红色显色区，尽量不要把薄层板烤糊影响观察，有时不会出现紫红色显色，可能是样品中没有可显色的化合物或者浓度太淡；观察、分析烤好的薄层板，若有单一的圆点，可换其他两种展开剂再次展开，如果仍为单一圆点，即可初步判断其为单体化合物，计算Rf值。

（6）合并相同馏分：将减压浓缩后的样品采用薄层层析检测，把薄层板上显色相同或相近但是明显不是单体化合物的样品合并，得到15 个馏分，记作Fr.A～Fr.O。再将这些馏分中的I 与J 再次合并后的馏分用硅胶柱层析法或高效液相色谱法等方法进行分离纯化，共得到3 个化合物并鉴定了其中2 个的化学结构，具体过程如图1。

1.2.4 Fr.I 和Fr.J 的分离纯化

将Fr.I 和Fr.J 合并浓缩，进行正相硅胶柱层析分离。采用干法上样、湿法装柱的方法，装柱上样完成后，依次用石油醚：丙酮[14∶1（1558ml）、10∶1（3759ml）、7∶1（2050ml）、4∶1（3092ml）、2∶1（2031ml）]、丙酮1240ml 进行梯度洗脱。得到8 个馏分，记作Fr.J1～Fr.J8。

经薄层层析分析，其中Fr.J5 组分可以做MCI脱色。依次用甲醇-水70%(600ml)、80%( 600ml)、90%( 6000ml)进行梯度洗脱。得到1 个馏分，仍记作Fr.J5。

经薄层层析分析，再对Fr.J5 组分做C-18 反相硅胶柱层析分离。依次用浓度为50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的甲醇-水1000ml 进行梯度洗脱。得到24 个馏分，分别记作Fr.J5A～Fr.J5X。

经薄层层析分析，其中Fr.J5J 组分适合做高效液相色谱法分离。经分离得到3 个化合物，记为化合物1、化合物2 和化合物3，即图3 中Fr J5J1、Fr J5J2 和Fr J5J3。

1.3 顶花胡椒抗菌活性研究

1.3.1 实验原理

将不同剂量的抗菌药物，分别加于融化并冷至45℃的定量琼脂培养基中，混匀，倾注成无菌平板，即为含有药物浓度递减的培养基；接种测试菌于该培养基上，经培养后观察被检菌生长情况，最低药物抑制细菌生长者，即最小抑菌浓度(MIC)。

1.3.2 实验方法

该实验采用琼脂稀释法，以M-H 琼脂作为实验琼脂培养基，阴性对照为DMSO，将待测目标物溶于DMSO，将试验待测的化合物分别稀释至如下浓度：32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL，分别接种试验菌种于37℃培养24h。测试其抗菌活性，以抑制微生物生长的最低药物浓度为MIC，以目标化合物抑制所选菌种80%生长率的浓度作为判断终点，并[14]参照Xing congli[14]等人的抗菌测定方法进行抗菌实验。

2 结果与分析

2.1 化学成分鉴定

该实验首先用乙醇对顶花胡椒粉末进行浸提，将浸提液减压浓缩得到浸膏；再分别用乙酸乙酯、石油醚进行萃取，得到乙酸乙酯及石油醚萃取物；利用各种类型、规格的硅胶柱层析以及高效液相色谱法对石油醚萃取物进行分离纯化，最终分离了3 个化合物并鉴定了其中2 个的化学结构。应用1H-NMR、13C-NMR 等核磁共振谱，高分辨质谱（HRMS）等现代结构解析方法，结合相关文献的数据鉴定出了这2个化合物的结构。化合物结构解析如下，结果见表1和表2。

表1 化合物1 的13C-NMR 和1H-NMR 数据Tab.1 13C-NMR and 1H-NMR Data of Compound 1

表2 化合物2 的13C-NMR 和1H-NMR 数据Tab.2 13C-NMR and 1H-NMR Data of Compound 2

化合物1：白色粉末（6.3mg），易溶于氯仿。应用1H-NMR、13C-NMR 推测其分子式为C20H21O7，分子量373。将其波谱数据与文献[16]对照，鉴定为5-methoxysesa-min，属于木脂素类，结构式见图2。

图2 化合物1 的化学成分结构Fig.2 Structure of Compound 1

化合物2：黄色固体（12.6mg），可溶于氯仿。应用1H-NMR、13C-NMR、MS 推测其分子式为C19H27NO4，分子量333。将其波谱数据与文献[15]对照，鉴定为Pipercallosidine，属于酰胺生物碱类，结构式见图3。

图3 化合物2 的化学成分结构Fig.3 Structure of Compound 2

2.2 抗菌活性测定

对分离得到的化合物1 和化合物2 进行了抗菌活性评价，实验结果见表3。

表3 顶花胡椒中2 个化合物的抗菌活性Tab.3 Anti-microbial Activities of 2 Compounds from Piper terminaliflorum

从表3 中可以看出：化合物1 对抗病原真菌（西瓜枯萎病菌、大豆炭疽病菌）和抗病原细菌（番茄青枯病菌）均有着不同程度的抑制作用，其最小抑菌浓度分别是12.6ug/mL、17.1ug/mL、11.7ug/mL；化合物2 对抗病原真菌（西瓜枯萎病菌、大豆炭疽病菌）和抗病原细菌（番茄青枯病菌）也有着不同程度的抑制作用，其最小抑菌浓度分别是12.4ug/mL、8.7 ug/mL、10.4ug/mL。

3 结论与讨论

3.1 结论

该实验提取出了顶花胡椒石油醚层的化学成分，最终分离纯化了3 个化合物并鉴定了其中2 个的结构式，确为单体化合物。分别为：化合物1，白色粉末，5-methoxysesamin（木脂素类），易溶于氯仿，质量6.3mg；化合物2，黄色固体，Pipercallosidine（酰胺生物碱），可溶于氯仿，质量12.6mg。抗菌活性测试结果表明：2 个化合物均对抗病原真菌（西瓜枯萎病菌、大豆炭疽病菌）和抗病原细菌（番茄青枯病菌）均有着不同程度的抑制作用。

3.2 讨论

目前仅对胡椒属中少数植物进行了深入研究，该属植物的化学成分和生物活性研究还有很大的空间。此次试验分离纯化得到并鉴定的2 个单体化合物均具有不同程度的抗真菌或抗细菌的作用，可见在研究具有抗菌作用的药物这一方面，顶花胡椒具有很高的利用价值以及研究前景，有望在今后对该植物的研究中得到更多新的具有抗菌作用的活性成分并将其制成新的药物。