黄瓜绿斑驳花叶病毒病防治方法的比较与展望

谢婷，罗金燕，陈磊，杜伟，朱洁，李斌*

（1.浙江大学生物技术研究所，杭州 310058；2.上海市农业技术推广服务中心，上海 201103；3.宁夏回族自治区农业技术推广总站，银川 750001；4.温州市植物保护与土壤肥料管理站，浙江 温州 325000）

黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）主要危害黄瓜、西瓜、甜瓜、丝瓜、葫芦、南瓜、笋瓜、西葫芦、瓠瓜、苦瓜、冬瓜等葫芦科作物，烟草等经济作物，以及北美苋、板枝苋、天芥菜、马齿苋、龙葵、菟丝子、紫苏等杂草；在人工接种条件下，CGMMV还可以感染茄科的三生烟和矮牵牛。CGMMV可造成葫芦科作物大规模减产甚至绝收，被CGMMV侵染的植物主要表现为花叶症状，但在不同寄主上其症状也不相同。受CGMMV感染的西瓜在发病后期甚至出现“倒瓤”现象，严重影响果实食用与经济价值。

该病毒自1935 年在英国首次被发现[1]以来，在全球范围内迅速扩散，目前已在澳大利亚、美国、加拿大、中国、日本、韩国、印度、英国、德国、法国等全球43个国家和地区流行。中国大陆最早在2002年从日本引入的种苗中第一次鉴定出了CGMMV，目前该病毒已在我国广泛分布，北至辽宁、南至广西、东至上海、西至甘肃的葫芦科作物生产基地均遭受到该病毒的威胁[2-3]。2006年农业部发布的第788号公告将CGMMV病列为全国农业植物检疫性病害，同时将CGMMV列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。该病毒主要通过种子等繁殖材料进行传播，一旦发生就很难控制，且无法根除，每年给瓜类生产业带来巨大的经济损失。

为有效降低因CGMMV造成的损失，促进我国瓜类安全生产，本文分析了CGMMV扩散流行的主要影响因素，总结了疫区和非疫区的防治策略，比较了现有各防治方法的优劣，并对CGMMV防治方法和技术前景进行了展望。

1 CGMMV 快速流行的主要因素

目前CGMMV在世界各地快速扩散和流行，人们难以有效地对其进行预防和控制，主要有以下几方面原因。

1.1 种子带毒

CGMMV 病毒粒子可以稳定存在于种子表皮与内种皮上，故带毒种子是病毒最重要的初侵染源。尽管脱毒种苗能够很好地预防该病毒的入侵，但一方面由于该病毒能存在于种子内、外表皮上，无法保证现有的检测技术能100%检测到种子上可能携带的少量病毒；另一方面，虽然目前已知干热处理对预防CGMMV有非常好的效果，但研究也表明干热处理会影响种子的活力，且对病毒的钝化效果和处理时间、温度等密切相关。由于不同葫芦科作物甚至同一作物不同品种对温度的敏感性都不同，需要制定差异化的干热处理规程。现有研究更多地聚焦在抑制CGMMV的活性上，而较少关注作物及其品种对温度和处理时间的反应。

1.2 病毒变异大

CGMMV 可以感染不同的寄主作物，利用病株汁液摩擦接种敏感的健康植株或苋色藜、曼陀罗、矮牵牛等试验寄主，根据发病症状，可将CGMMV分为6 个株系，不同株系之间的生物学特性存在差异，而且各株系间的基因组存在明显分化。通过检索NCBI 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）发现，CGMMV 的基因组序列信息仍在不断增加，表明越来越多的分离物被获得且基因组被测定，这在一定程度上反映了该病害的扩散仍在继续。通过收集NCBI数据库中所有CGMMV中国分离物的基因组序列并构建系统发育树（图1），聚类分析结果表明，我国各分离物的基因组差异明显，存在着丰富的遗传多样性，这给CGMMV的检测和防治带来了严峻的挑战。

图1 CGMMV核苷酸序列的系统进化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of CGMMV nucleotide sequences

1.3 传播途径广

CGMMV的近距离传播主要通过摩擦或机械传播方式实现，包括农事操作、嫁接、授粉、病株枝叶摩擦等；该病毒还可以随雨水、灌溉水、营养液等流动水源在田间扩散；一些受污染的器具也可作为该病毒的传播媒介；用作肥料的牛粪以及兔、老鼠等啮齿类动物的粪便[4]也可传毒；有报道称黄瓜叶甲在CGMMV的传播过程中发挥作用，但传播瓜类病毒的常见媒介昆虫如桃蚜和棉蚜却并不传播CGMMV[4]。CGMMV的远距离传播主要通过带毒种子完成，在带毒种子培育出的花瓣、雄蕊、花粉中均可检出该病毒。次要初侵染源为残留于土壤中的上茬作物残体，再侵染源主要为早期发病苗。据报道CGMMV在土壤中存活14个月后仍有致病力[5]。CGMMV多样的传播方式给该病毒的有效防治造成了较大的困难。

2 现有的防治策略及其优劣势分析

2.1 加强植物检疫与带毒种子检测，防止其进入未入侵地区

CGMMV 作为一种危害严重、传染性强、防治困难的检疫性有害生物，其最有效的防治手段就是加强植物检疫。在CGMMV 未发生流行的地区更要加强对该病毒的检疫，严格实施产地检疫以切断初侵染源，健全检疫管理体系与相关法规，普及检疫知识；进行人为调种时，必须按照流程办理检疫证书，这样在防止疫区内病毒大范围扩散的同时也能将病毒阻断在非疫区之外。种子种苗调运过程中，对带毒种子的检测是植物检疫中至关重要的环节。2019 年5 月，浙江省宁波海关从来自德国的邮件中截获1 袋携带CGMMV 的种子，这是全国首次从非法邮寄进境的植物种子中截获该病毒，从而有效地阻断了该病毒的远距离传播[6]。目前CGMMV检测主要包括血清学与分子生物学方法，二者各有优劣。

2.1.1 血清学检测

血清学方法依赖于制备特异性强的高纯度抗血清，主要包括双抗体夹心酶联免疫吸附测定（double antibody sandwich-enzyme-linked immunosorbant assay, DAS-ELISA）、间接ELISA、斑点免疫杂交ELISA（dot-ELISA）在内的ELISA方法和适用于现场检测的试纸条技术[7-8]。ELISA 适用于大规模样品的快速检测，兼具特异性好、灵敏度高、操作简便等优点。基于多克隆抗体建立的间接ELISA 法检测CGMMV 的灵敏度可达4.75×10－5mg[9]；近期有研究者通过dot-ELISA首次在海南地区的辣椒和番茄上检测到了CGMMV[10]。基于血清学原理研发的胶体金免疫层析试纸条、磁免疫层析试纸条、荧光纳米颗粒试纸条可在很短的时间内得出检测结果，对操作人员的技术要求不高，适用于田间样品快速检测。

2.1.2 分子生物学检测

与血清学方法相比，分子生物学检测灵敏度更高、特异性更强，仅需少量样品就可得出较为可靠的结果。目前广泛应用的分子生物学检测方法是反转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR），但其检测成功率很大程度上取决于提取的RNA质量；而试管捕捉RT-PCR和免疫捕捉RT-PCR分别以病毒提取液或特异性抗体捕捉病毒粒体，省去了RNA 提取步骤，其中免疫捕捉RT-PCR 具有免疫特异性和PCR 高灵敏度[11]；实时荧光RT-PCR 与RT-PCR 相比检测时间短，灵敏度高，且产物不需电泳检测[12]，但需要昂贵的试剂与仪器。免疫磁珠RT-PCR利用免疫磁珠直接吸附病毒颗粒进行RT-PCR 检测，省去了RNA 抽提步骤，大大缩短了检测时间且增加了检测灵敏度。细菌磁颗粒RT-PCR利用细菌磁颗粒非特异性收集病毒颗粒，从而简化RNA 提取步骤，操作简便。环介导等温反转录扩增技术和重组酶聚合酶等温扩增技术对仪器要求低，操作简便，结果肉眼可见，适用于基层现场的带毒种子种苗检测。

2.2 采用以种子消毒为主的综合防治措施，减少入侵区的危害

目前还缺乏较为有效的防治CGMMV 的方法。对于已经被病毒入侵的区域，在生产中常采用综合治理技术，其中种子消毒处理已被证实防治CGMMV 的效果最好，其原理是种子干热处理可钝化CGMMV，从而切断初侵染源。农业防治CGMMV 的方法有建立无病留种田、及时拔除病株、进行合理轮作等，此外农事操作中所用的器具、有机肥、嫁接用的砧木都要保证无毒。还可以采取在栽培葫芦科作物的温室中或田间诱杀媒介昆虫的措施来降低CGMMV 的传播概率。其他综合防治措施还包括土壤熏蒸消毒、喷施化学药剂、生物防控、选育抗病品种以及利用抗病基因工程帮助作物抵抗CGMMV的侵染等。

2.2.1 种子干热消毒

种子干热消毒是目前防治CGMMV 的一项重要且最为有效的措施[13-14]，其基本原理是物理高温破坏CGMMV 的粒子结构[15]，使依附在种子表皮的病毒钝化从而失去侵染能力。干热处理不仅可以杀死黏附在种子表面的病毒，还可以杀死潜伏在种子内部的病毒[16]。有研究认为，杀灭CGMMV 的有效温度为72 ℃，低于这个温度则没有效果[17]。干热处理时温度过高虽也可使病毒完全钝化，但此时种子发芽率会大幅度降低[18]，这主要是由于温度太高或处理时间太长时产生的热量会透过种皮杀死胚芽[19]，因此干热处理时需要严格控制处理温度与时间。不同种类葫芦科种子对干热处理的温度敏感性不同，即使是同一植物不同品种的种子，其对干热处理的温度敏感性也有差异（表1），但目前为止在生产上仍没有制定出针对不同葫芦科作物带毒种子的干热处理标准。此外，经干热处理的种子无法长时间贮存，应适时进行播种。

表1 携带CGMMV的不同葫芦科作物种子干热处理措施Table 1 Dry heat treatment measures on different seeds of cucurbitaceous crops infected with CGMMV

2.2.2 化学药剂

截至目前，仍无可有效防控CGMMV的化学药剂的报道，但化学药剂可作为防治CGMMV的辅助手段，如播种前可采用10%磷酸钠处理种子[18]，使用溴甲烷对育苗地和已发病地块进行土壤消毒[5]；在发病初期，使用2%宁南霉素水剂稀释200 倍液、0.5%植病灵水剂1 000 倍液、40%病毒灵可溶性粉剂1 000 倍液[25]，5%菌毒清可湿性粉剂300 倍液、30%毒克星可湿性粉剂500 倍液、植物病毒钝化剂912兑水15 kg[26]，高锰酸钾1 000倍液或硫酸锌1 500倍液[27]，20%吗胍·乙酸铜可湿性粉剂500 倍液[28]，1.8%宁南霉素水剂1 000 倍液[29]等均匀喷雾，可在一定程度上抑制CGMMV 的扩散蔓延（表2）。目前已报道的针对具体作物喷施的化学药剂的剂型与稀释倍数较为明确，但其中大多数药剂仍缺乏规范的施用周期、剂量和次数等信息。

表2 发病初期用于防治CGMMV的药剂Table 2 Pesticides used for the control of CGMMV in the early stage

除了直接用药剂喷施发病植株外，一些化学诱抗剂也可诱导植株对CGMMV产生抗性，从而降低植株被感染的概率，如2，1，3-苯并噻二唑、油菜素内酯、壳聚糖、水杨酸4种化学诱抗剂均能诱导瓠瓜对CGMMV 产生抗性，其抗性差异与诱抗剂种类、浓度及诱导时间相关[30]。化学药剂单独作用时功能有限，生产上通常采取以干热处理为主的种子综合处理措施防治CGMMV，取得了很好的效果。例如对感染CGMMV嫁接砧木种子的5种处理方式的防效进行比较，其排序为干热处理结合药剂消毒＞干热处理＞温汤浸种结合药剂消毒＞药剂消毒＞温汤浸种[31]。

2.2.3 生物防治

随着绿色植保理念的发展，人们开始关注生防菌、植物提取物以及弱毒株系等新生物源农药，例如卫甜等[32]从CGMMV发病严重的黄瓜根围土中分离、筛选获得了稳定防效在40%以上的菌株9个。研究人员陆续发现了一些对植物病毒起钝化作用的植物抽提物，这些物质有强烈的体外钝化、抑制其增殖和诱导植株抗病性的作用[33]。早期研究发现，在温室黄瓜上喷洒狭叶钩粉草提取物可诱导植株对CGMMV产生抗病性[34]；从鸦胆子种子中提取得到的鸦胆子素D，其10µg/mL质量浓度就可抑制CGMMV的复制酶基因、运动蛋白基因、外壳蛋白基因的表达，从而有效抑制病毒的侵染与增殖，使病毒粒子解离，抑制率可达80%左右[35]。CGMMV的弱毒株系可以对强毒株系起到交叉保护的作用，即预先接种弱毒株系的植株对强毒株系的侵染能表现出一定的抗性，例如从发病甜瓜中分离到的1株CGMMV-SH33b弱毒株，可用于保护甜瓜免受野生CGMMV的侵害[36]。

2.2.4 抗病品种和砧木

21世纪初，有研究者采用随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA, RAPD）标记技术对甜瓜栽培品种的抗CGMMV 基因进行标记和抗病育种[37]；也有研究者利用胚胎拯救技术获得了2 个黄瓜品种的CGMMV 种间杂交抗性材料[38]。近年来，我国针对CGMMV 的抗病选育工作也有了很大进展，例如钟敏等[39]以CGMMV 野生株系为试验材料，开发了一种可通过人工诱变快速筛选CGMMV弱毒株的方法，为CGMMV弱毒疫苗的开发奠定了基础。张圣平等[40]利用自交系父母本配制的温室黄瓜新品种‘中农33 号’，可中抗CGMMV。由于CGMMV可通过嫁接方式传播，不同砧木和葫芦科作物品种间的耐病性差异较大，故砧木的选择也显得尤为重要。

2.2.5 定点突变构建弱毒株系

基因编辑技术的崛起为研究者们在分子层面上探究如何利用病毒的致病基因与植物的抗性基因提供了良好的技术基础。而基于CGMMV 外壳蛋白、复制蛋白、运动蛋白序列的基因位点改造已被证实可影响病毒的复制、侵染与定殖，通过修改病毒基因组可以构建CGMMV 的弱毒株系进而对植物进行交叉保护。有研究表明，通过基因定点突变将CGMMV复制酶第1 069位的谷氨酸和衣壳蛋白第89位的天冬氨酸分别突变为丙氨酸，均可导致CGMMV 致病力显著降低，交叉保护试验表明这2 个突变体对野生型CCMMV的交叉保护效率分别为91.7%和100.0%[41]。

2.2.6 抗病基因工程

CGMMV为RNA病毒，可将病毒特异性的基因序列导入寄主中诱发植物自身的RNA 干扰机制，从而产生对病毒的抗性。例如有研究者利用编码CGMMV外壳蛋白的基因cDNA构建了抗CGMMV西瓜砧木并成功转化和表达[42]，这是通过基因工程技术培育抗CGMMV 感染西瓜的首次报道。通过扩增CGMMV运动蛋白全长基因，构建能诱导形成双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）的原核表达载体并转化大肠埃希菌，经异丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside, IPTG）诱导提取的dsRNA能有效抑制CGMMV侵染黄瓜[43]。将CGMMV运动蛋白基因的反向重复序列转化甜瓜后，所获得的转基因甜瓜植株对病毒具有较高的抗性[44]。在转基因西瓜中已发现不同病毒CP基因片段的融合有助于通过转录后基因沉默实现多重病毒抗性，如将西瓜银色斑点病毒的部分N 端序列与黄瓜花叶病毒、CGMMV、西瓜花叶病毒的部分CP基因序列融合并转化西瓜，获得了2个对烟草花叶病毒、CGMMV和西瓜花叶病毒均表现为抗性的株系[45]。葫芦科作物通常被多种病毒复合侵染，具有广谱抗性的转基因植株在实际生产中具有很好的应用潜力。

3 小结

现有的CGMMV主要防治方法各有优缺点（表3），而种子消毒处理为早期预防CGMMV的有效举措。病毒刚在田间显症时可通过喷施化学药剂进行控制，但药剂只能暂时抑制病毒增殖从而延迟病害症状出现，一旦停止用药病毒即恢复增殖。生物防治对环境友好，但在田间应用时受环境影响而导致药效不稳定；利用弱毒株系的交叉保护作用在实验室及田间实验中都表现出了良好的防效，但目前逐一在植物上接种弱毒株系在葫芦科作物的商品化生产中很难实现；选育抗病品种无疑是有效的途径，然而CGMMV基因组的快速变异会导致选育植物品种抗性的丧失；基于分子层面的基因改造逐渐成为遗传育种的新方向，但现有技术仍不够成熟。当前，新型抗病毒药剂的开发工作与基于基因工程技术的CGMMV 防治策略正在不断摸索中稳步推进，为该病毒的防治提供了新途径。

表3 目前主要的CGMMV防治技术比较Table 3 Comparisons of the current main CGMMV control technologies

4 展望

4.1 新型抗CGMMV 药剂的研发

创制新型、高效、低毒的植物源抗病毒药剂是防治CGMMV的方向之一，早在21世纪初学者们就发现多种植物抽提液对植物病毒有钝化作用[38]。近年来，随着一些天然抗植物病毒活性成分不断被发现，人工合成开发了一系列对环境与寄主植物友好的新型抗病毒药剂，弥补了传统化学药剂应用的局限性，例如以天然产物（－）-incrustoporin 为结构先导设计合成了具有抗烟草花叶病毒活性的系列3-芳基-5-甲基-γ-丁内酯，其对烟草花叶病毒的钝化、保护、治疗效果均高于对照药剂病毒唑[46]。这些新型植物抗病毒药剂多数起到钝化病毒的作用，少数可以起到治疗与诱导植物抗性的作用。显然，基于天然产物结构的多样化衍生为创制新型抗CGMMV等植物病毒药剂提供了指导性意见。

4.2 植物基因工程及其纳米辅助技术抗CGMMV

鉴于瓜类等葫芦科作物遗传转化难度大，利用病毒诱导的基因沉默对葫芦科作物进行基因挖掘有利于抗病毒分子育种。2020年LIU等首次报道了将CGMMV设计为病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）载体并成功沉默了西瓜、葫芦等瓜类作物中β-胡萝卜素合成过程中的一个关键酶基因[47]，该载体可作为进一步开展抗病毒基因工程的基础。微小RNAs（microRNAs,miRNAs）是存在于真核生物中的一类具有可参与病毒防御调节途径的内源性非编码RNA，大小为20～25 个核苷酸，miRNAs 中特定序列进行人工改造后的碱基序列被称为人工miRNAs，对3 个靶向CGMMV RNA的人工miRNAs 的鉴定结果表明其表达可降低发病植物中病毒的复制率与侵染率[48]。通过运用人工miRNAs 技术，可有效降低因病毒进化导致的植物抗性丧失概率，达到通过培育抗病毒作物防治CGMMV的目的。

纳米材料已被发现对作物病原真菌和细菌具有良好的抑制效果，虽然很少见到其对植物病毒的直接作用效果的报道，但其已作为一种辅助手段被应用于基于基因编辑技术衍生的“RNAi 农药”上。RNAi农药是指体外制备的能够诱发病毒基因沉默从而达到防治目的的dsRNA或者siRNA产品，但在应用过程中常常会因为dsRNA 易降解而限制其在生产上的使用，但如果将dsRNA与纳米材料结合就可以增加制剂的稳定性，这在烟草花叶病毒上已被证实。例如将烟草花叶病毒衣壳蛋白基因目的片段体外合成的dsRNA与纳米壳聚糖融合成壳聚糖-dsRNA 制剂，可对dsRNA 起到良好的保护、缓释及提高稳定性的作用，可对烟草花叶病毒有良好预防和治疗效果[49]，虽然纳米材料在防治植物病毒上的效果仍有待挖掘证明，但这些结果清楚地显示纳米材料在利用RNA 干扰防治CGMMV 中亦具有良好的应用前景。