低共熔溶剂提取绵马贯众中总间苯三酚类成分的工艺研究

赵晋彤，阚晶晶，季宇彬

(1.哈尔滨商业大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150076；2.哈尔滨商业大学 中药学博士后科研流动站，黑龙江 哈尔滨 150076)

绵马贯众是我国常用中药，间苯三酚类化合物是其主要活性成分[1]，具有较好的抗病毒、抗肿瘤、抗菌以及抗氧化活性[2-5]，因此，对其进行高效、绿色提取具有重要意义。

低共熔溶剂(DES)是近年来备受关注的新型绿色溶剂，其不仅具有离子液体的所有优点，同时还具有价格低廉、易于降解及生物相容性好等特性[6-7]，已应用于多糖类[8]、黄酮类[9]以及精油[10]的提取，提取效果较好。

本研究以DES为提取溶剂，通过单因素实验以及响应面分析法对绵马贯众中总间苯三酚类成分的提取工艺进行优化，以期为绵马贯众的深度开发利用提供参考，并拓展低共熔溶剂的应用范围。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

绵马贯众，哈尔滨三棵树药材市场；绵马贯众素ABBA标准品、坚牢蓝BB盐、氯化胆碱、尿素、1，4-丁二醇、无水乙醇均为分析纯。

KQ-3000E型超声波清洗仪；UV-5800紫外可见分光光度计；ME104E电子分析天平；SHB型循环水式真空泵；HH-2数显恒温水浴锅。

1.2 实验方法

1.2.1 DES的制备 将氯化胆碱、尿素和1，4-丁二醇按照1∶2∶2的摩尔比混合，50 ℃加热搅拌 2 h，直至形成透明的DES溶液。临用前，与一定体积的蒸馏水混合，即得DES提取溶剂。

1.2.2 间苯三酚提取 称取一定量的绵马贯众粉末，与含水量60%的DES提取溶剂混合，液料比 15∶1 mL/g，提取60 min。抽滤，去除药渣，取上清液于250 mL容量瓶中，70%乙醇定容，即得供试液。将供试液稀释至适宜浓度，按照1.3节方法显色，并测定吸光度，按下式计算绵马贯众中总间苯三酚得率。

式中W——总间苯三酚得率，%；

m1——供试液的总间苯三酚质量，g；

m2——绵马贯众原料的质量，g。

1.3 标准曲线的绘制

精密称取绵马贯众素ABBA标准品11.4 mg，70%乙醇溶解，定容于25 mL容量瓶中，即得 456 μg/mL 的标准品母液。精密吸取一定体积的标准品母液于10 mL试管中，用70%乙醇分别稀释至2 mL，随后加入0.5%坚牢蓝BB盐溶液5 mL，混匀，室温避光放置20 min后，于476 nm波长下测定吸光度[11]。以吸光度为纵坐标，绵马贯众素ABBA标准品的浓度为横坐标，制作标准曲线，得回归方程y=0.022x+0.130 3，R2=0.999，绵马贯众素ABBA标准品浓度在6.51～32.57 μg/mL范围内与吸光度呈现良好的线性关系。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 含水量对总间苯三酚得率的影响 水能够调节DES提取溶剂的极性，并且可以降低其黏稠度，有利于提高超声波的空化效应，提高提取效率[12]。实验结果见图1。

图1 DES含水量对总间苯三酚得率的影响Fig.1 Effect of DES water content on the yield of phloroglucinol derivatives

由图1可知，随着DES中含水量的增加，总间苯三酚得率逐渐升高，含水量为60%时，总间苯三酚得率达到最高。继续增加含水量，可能会影响DES提取溶剂的分子间氢键，使其结构发生改变，从而减弱DES与间苯三酚类成分间的作用力，导致得率下降[13]。因此，低共熔溶剂体系最佳含水量为60%。

2.1.2 液料比对总间苯三酚得率的影响 实验结果见图2。

图2 液料比对总间苯三酚得率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of phloroglucinol derivatives

由图2可知，当液料比增加到15∶1 mL/g时，总间苯三酚得率呈上升趋势，之后随着液料比增加，总间苯三酚得率呈下降趋势。其原因为：液料比的增加，使得药材与DES的接触面积和分散度增大，促进间苯三酚类成分的提取，其得率升高[14]；但随着液料比的继续增加，过量溶剂消耗超声波能量，使其提取效率下降，造成间苯三酚类成分得率降低。因此，选取15∶1 mL/g为最佳液料比。

2.1.3 提取时间对总间苯三酚得率的影响 由图3可知，超声时间为30～60 min时，总间苯三酚得率保持上升趋势，在超声提取60 min时，总间苯三酚得率达到最大值，之后随提取时间延长而降低。提取时间过短，使目标成分提取不彻底，而提取时间过长，则可能会导致总间苯三酚类成分结构破坏，得率降低。因此，提取时间选取60 min较为适宜。

图3 提取时间对总间苯三酚得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the yield of phloroglucinol derivatives

2.2 响应面分析法优化提取工艺

结合单因素实验结果，选取Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken实验设计。选取含水量、液料比、提取时间为影响因素，总间苯三酚得率为考察指标，设计3因素3水平的响应面分析实验。实验因素水平见表1，实验结果见表2。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

表2 响应面实验结果Table 2 Response surface experiments results

利用Design-Expert 8.0.6软件对实验数据进行回归拟合与方差分析(表3)，得到总间苯三酚得率(Y)对3个因素的二次多项回归方程为：Y=18.77+0.57A+0.33B+0.15C-0.21AB-0.51AC-0.66BC-1.15A2-0.72B2-1.33C2。

由表3可知，该模型的F值为40.77，P<0.000 1，表明该模型极显著；失拟项P值为 0.388 2，不显著，说明该模型与实验有良好的拟合性。一次项含水量、液料比，交互项含水量与提取时间、液料比与提取时间以及3个因素的二次项对响应值有极显著影响(P<0.01)。依据F值可知，对总间苯三酚得率影响因素强弱为A(含水量)>B(液料比)>C(提取时间)。

表3 回归模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface regression mode

响应面曲线图见图4。

图4 各因素交互作用对总间苯三酚得率影响的响应面图Fig.4 Response surface plots of the effects among factors on the yield of phloroglucinol derivatives

由图4可知，交互项含水量及液料比的响应曲面倾斜度较小，等高线形状近圆形，说明其交互作用对响应面值的影响不显著。而含水量及提取时间、液料比及提取时间的响应曲面倾斜度较大，等高线形状近椭圆形，说明其交互作用对响应面值的影响显著。

2.3 验证实验

通过Design Expert 8.0.6软件分析可知，最佳提取工艺为含水量62.39%，液料比为16.08∶1 mL/g，提取时间为59.57 min，预测总间苯三酚得率为 18.87%。将最佳提取工艺修正为：含水量62%，液料比为16∶1 mL/g，提取时间为60 min，得到总间苯三酚得率为18.59%，略低于预测值。与经典提取方法比较，DES溶剂提取总间苯三酚类成分得率略高，表明低共熔溶剂作为绿色、高效的提取溶剂，可用于绵马贯众中总间苯三酚类成分的提取。

3 结论

采用超声辅助低共熔溶剂法提取绵马贯众中的总间苯三酚类成分的最佳提取工艺条件为：含水量为62%的氯化胆碱、尿素和1，4-丁二醇组成体系为提取溶剂，在液料比16∶1 mL/g，提取时间60 min时，总间苯三酚得率为18.59%。该方法具有操作简单、绿色安全、提取效率高等优点。为绵马贯众中间苯三酚类成分提取提供新方法，同时也将为利用低共熔溶剂提取天然产物活性成分提供理论参考。