基于网络药理学探讨桂枝茯苓丸治疗脑水肿作用机制

区凤娟 高芳瑜 余尚贞 张家明 刘晓林

[摘要]目的运用网络药理学方法探究桂枝茯苓丸治疗脑水肿的潜在效应机制。方法利用TCMSP收集桂枝茯苓丸化学成分及其靶标基因。通过OMIM、GeneCards、Drug Bank等数据库获取脑水肿疾病靶标基因。将成分靶标、疾病靶标交集部分上传至String数据库，构建中药成分靶标-疾病靶标蛋白互作网络，并计算网络特征值，筛选出关键靶标。借助Metascape分析平台对关键靶标进行GO分析和KEGG通路富集分析。结果共获取桂枝茯苓丸44个活性成分，作用靶标206个;桂枝茯苓丸治疗脑水肿交集靶标128个，相互作用核心基因为AKT1、IL-6、VEGFA等，其主要作用通路为糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、癌症相关通路、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路等。结论桂枝茯苓丸治疗脑水肿的效应机制可能与炎症反应、抗氧化应激、稳定血脑屏障等相关。

[关键词]桂枝茯苓丸;脑水肿;网络药理学;靶点;作用机制

[中图分类号]R273

[文献标识码]A

[文章编号]2095-0616（2022）11-0018-05

脑水肿是指各种病因引起的脑内水分异常增加，导致脑容积增大的病理现象[1]。脑水肿可显著提高颅内压，如果不加以控制，高颅压会压迫周围的脑组织，导致脑组织缺血、脑疝，甚至死亡[2]。目前临床上常用的治疗脑水肿的药物为渗透性利尿剂甘露醇和高渗盐水，这两种药物可暂时降低颅内压，然而其可能导致急性肾功能衰竭、低血压、溶血和充血性心力衰竭，还可能诱发颅内压的反弹[3]。桂枝茯苓丸源自《金匮要略·妇人妊娠病脉证并治》第二十篇：“妇人宿有癥病，经断未及三月......当下其癥，桂枝茯苓丸主之。”该方由桂枝、牡丹皮、桃仁、芍药以及茯苓5味药物研末炼蜜和丸而成，具有活血利水、化瘀消癥的功效。桂枝茯苓丸用于治疗妇科疾病已有数千年，现代研究也发现其可用于治疗水肿性疾病，尤对于水瘀互结类疾病具有独特疗效，譬如糖尿病肾病性水肿、脑水肿、心源性水肿[4-6]。颅脑水瘀是脑水肿疾病进展中重要的病机[7]，桂枝茯苓丸具有活血利水之效，然而临床上关于桂枝茯苓丸治疗脑水肿的研究较少。由于脑水肿起病急、进展快，是造成高病死率[8]以及不良预后[9]的重要原因，然而目前并无显著有效的药物或手段治疗脑水肿，因此，探究桂枝茯苓丸治疗脑水肿多靶点、多通路的效应机制具有积极意义。

网络药理学是通过“药物-靶标-基因-疾病”相互作用网络，探索药物与疾病之间的关系的分析方法[10]。本研究拟运用网络药理学分析方法，从多层次揭示桂枝茯苓丸治疗脑水肿的潜在效应机制，为其进一步药理作用研究和临床应用提供依据。

1资料与方法

1.1药物活性成分及靶点收集

以桂枝、茯苓、赤芍、桃仁、牡丹皮5味中药为关键词，使用TCMSP平台（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）查询上述药物的所有成分，然后根据ADME参数（OB≥30%、DL≥0.18）筛选出可能的活性药物小分子。将筛选的药物活性成分引入TCMSP、DrugBank[11]（https：//go.drugbank.com/）预测其靶点，再将上述获得的药物作用靶点输入Uniprot[12]数据库中查询靶点蛋白对应的基因简称，剔除非人源靶点后得到药物候选靶点。

1.2脑水肿靶标收集

本研究以cerebral edema、brain edema作为脑水肿的關键词，通过检索Drug Bank、OMIM[13]（https：//omim.org/）、GeneCards[14]（https：//www.

genecards.org/）数据库构建脑水肿靶标数据库。

1.3蛋白互作网络（PPI）构建与分析

将桂枝茯苓丸预测靶标及脑水肿疾病靶标上传至Venny2.1.0（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）在线分析工具，获取两者共同靶标，绘制Venny图。将桂枝茯苓丸成分靶标、脑水肿疾病靶标交集部分导入String[15]数据库，构建中药成分靶标-疾病靶标PPI网络。使用Cytoscape3.8.2软件分析其网络拓扑特征值，进行可视化处理。

1.4基因功能及通路富集分析

将筛选后的靶点导入Metascape平台进行基因本体论（Gene Ontology，GO）分析[16]及KEGG通路富集分析[17]，保存其结果并以图表形式展示。

2结果

2.1桂枝茯苓丸活性成分及靶点获取

通过TCMSP数据库收集到5味药物44个活性成分，包括山萘酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）、β-谷固醇（beta-sitosterol）、鞣花酸（ellagic acid）、芍药苷元（paeoniflorgenone）、芍药苷（paeoniflorin）、baicalein（黄芩素）、Baicalin（黄芩苷）等成分。将44个药物活性成分进行处理，最终得到5味药物候选靶点206个。

2.2脑水肿靶标收集

检索GeneCards、OMIM、DrugBank疾病数据库，得到脑水肿靶点个数分别为8327、465、126个，筛选并去除重复值后得到靶点1978个。药物靶点与疾病靶点交集为128个。见图1。

2.3PPI网络构建与分析

将桂枝茯苓丸治疗脑水肿的候选靶标上传至STRING数据库，构建PPI网络。计算网络特征值共获取关键靶标32个，关键靶标间相互作用关系454条。利用Cytoscape3.8.2软件对脑水肿靶标相互作用网络进行可视化处理。研究结果显示，桂枝茯苓丸治疗脑水肿的效应机制可能与AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3、TP53、TNF、EGF、JUN、MAPK8、MAPK1、EGFR、PTGS2、MMP9等基因相关。见图2。

2.4桂枝茯苓丸治疗脑水肿基因功能分析结果

为进一步了解桂枝茯苓丸治疗脑水肿关键靶标在生物体中发挥的作用，通过Metascape数据库对128个关键靶标进行GO基因功能分析，包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞成分（cellular component，CC）分析。根据-Log10（P）大小进行排序，选取前10个条目展示。见图3。

2.5桂枝茯苓丸治疗脑水肿通路富集分析结果

通过Metascape数据库对桂枝茯苓丸治疗脑水肿关键靶标进行KEGG通路富集分析，选取前10个条目展示。见图4。

3讨论

从上述结果可知，桂枝茯苓丸治疗脑水肿的主要成分可能为山萘酚（kaempferol）、β-谷固醇（beta-sitosterol）、槲皮素（quercetin）等。现代药理学研究发现山萘酚、β-谷固醇、槲皮素均具有免疫调节、抗炎等药理作用[18-20]。槲皮素还能抑制凝血酶和凝血因子的活性[21]。而脑水肿形成过程与炎症因子、凝血酶等具有相关性[22]。桂枝茯苓丸治疗脑水肿的靶点相互作用网络直观体现了靶点间的相互作用，根据PPI结果，该网络的核心靶点为AKT1、IL-6和VEGFA。AKT1可通过PI3K/AKT通路调控炎症因子基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的合成或释放，从而改变内皮细胞和血管通透性[23]，影响血脑屏障中紧密连接相关蛋白的功能[24]，加重脑水肿。IL-6作为常见的炎症因子，可促进炎症瀑布效应的形成[25]，IL-6的分泌可增加血脑屏障的通透性，扩大脑水肿[26]。VEGFA具有促进神经功能修复、诱导神经发育和血管生成的作用[27]，对于血脑屏障的完整性和内皮细胞的存活是必不可少的[28]。当VEGFA高表达时，可导致血管通透性增加，破坏血脑屏障功能，使中枢神经系统稳态失衡[29]。本研究结果表明，AKT1、IL-6和VEGFA均与脑水肿的形成以及进展相关，故桂枝茯苓丸可能以AKT1、IL-6和VEGFA为主要作用靶点，通过调节炎症反应以及内皮细胞功能以改善脑水肿。

根据生物学过程（GOBP）、分子功能（GOMF）、细胞组分（GOCC）富集结果分析可见，桂枝茯苓丸治疗脑水肿的机制可能与对无机物的反应、活性氧代谢过程、炎症反应、凋亡信号通路、血管发育、蛋白质结构域特异性结合、细胞因子受体结合、蛋白酶结合过程、脂筏、树突等密切相关。现代医学认为，脑水肿过程涉及血脑屏障结构功能的损害和脑细胞能量代谢的障碍，其中包括细胞毒性水肿、离子水肿以及血管源性水肿[30]。细胞毒性水肿和离子水肿的形成涉及多种离子通道和转运体，包括磺酰脲类受体-1-瞬时受体电位离子通道蛋白4（SUR-1-TRPM4）、钠钾氯共转运体1（NKCC1）、钠氢交换器（NHE）、兴奋性氨基酸转运体（EAATs）和水通道蛋白[31-33]。多种因子包括MMPs、P物质、血管内皮生长因子（VEGF）、凝血酶和促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子、IL-6和IL-1β）促进血管源性水肿的发生[34-36]。在上述脑水肿的过程中可发现其包含了无机物的反应、活性氧代谢过程、炎症反应、凋亡信号通路的生物学过程，涉及了血管发育、蛋白质结构域特异性结合、细胞因子受体结合、蛋白酶结合等分子功能，利用了脂筏、樹突等结构，与GO分析结果相符。

根据KEGG通路富集分析结果显示桂枝茯苓丸治疗脑水肿的主要效应通路为AGE-RAGE、IL-17、PI3K-Akt等多条信号通路。在AGE-RAGE信号通路中，RAGE在炎症反应中起促炎性递质的作用[37]。AGEs是RAGE的重要配体，AGEs可作用于其受体RAGE，从而激活小胶质细胞（MG），诱导其释放IL-1β和TNF-α。IL-1β既可上调星形胶质细胞或MG表达其他细胞因子，还可使一氧化氮、前列腺素、补体、氧自由基、β-淀粉样前体蛋白等物质生成增加，引起中枢神经系统损伤[38]。AGEs还可激活活性氧簇相关的转录因子NF-κB等，进而引发炎症和氧化应激反应，导致炎症因子高表达，损害大脑皮质神经元的结构及功能[39]。根据KEGG通路富集最显著的AGE-RAGE信号通路推断，桂枝茯苓丸治疗脑水肿机制可能与抗氧化、抑制炎症反应相关。

脑水肿发病机制较为复杂，而目前尚无关于桂枝茯苓丸治疗脑水肿的有效成分、靶点和机制的报道。根据网络药理学结果综合分析，桂枝茯苓丸治疗脑水肿的机制主要涉及炎症反应、抗氧化应激、稳定血脑屏障等。目前多数基于网络药理学的研究仍在静态网络分析中，然而人体功能是一个连续的动态过程。因此，桂枝茯苓丸治疗脑水肿的活性成分、有效途径等仍需进一步的实验验证。

[参考文献]

[1] JCook Aaron M，Morgan Jones G，Hawryluk Gregory WJ，et al.Guidelines for the Acute Treatment of Cerebral Edema in Neurocritical Care Patients[J].Neurocritical Care，2020，32（3）：647-666.

[2] Halstead Michael R，Geocadin Romergryko G.The Medical Management of Cerebral Edema： Past， Present， and Future Therapies[J].Neurotherapeutics： the Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics，2019，16 （4）：1133-1148.

[4]李露，贺小兰.桂枝茯苓丸联合真武汤治疗糖尿病肾病性水肿的临床观察[J].内蒙古中医药，2020，39（1）：22-23.

[5]李彦杰，卢永保，李斯锦.桂枝茯苓丸在异病同治中的应用[J].中医临床研究，2019，11（16）：99-101.

[6]王亚方，郑爱华.桂枝茯苓丸合芩桂术甘汤治疗慢性心力衰竭急性发作临床观察[J].中国中医药现代远程教育，2021，19（3）：103-105.

[7]周子懿，王立新，黄培新.脑水肿的中医证治探讨[J].中华中医药杂志，2020，35（2）：760-763.

[8] Antonio Muscari，Luca Faccioli，Maria Vittoria Lega，et al. Predicting cerebral edema in ischemic stroke patients[J]. Springer International Publishing，2019，40（4）： 745-752.

[9] Matthew A.Koenig.Cerebral Edema and Elevated Intracranial Pressure[J].CONTINUUM：Lifelong Learning in Neurology，2018，24（6）：1588-1602.

[10]潘家祜.基于網络药理学的药物研发新模式[J].中国新药与临床杂志，2009，28（10）：721-726.

[11] WISHART DS，FEUNANG YD，GUO AC，et al. DrugBank 5.0： a major update to the DrugBank database for 2018[J].Nucleic Acids Research，2018，46（1）： 1074-1082.

[12] Alex Bateman，Maria Jesus Martin.UniProt： the universal protein knowledgebase[J].Nucleic Acids Res， 2018，46（5）：2699.

[13] Joanna S Amberger，Carol A Bocchini，Alan F Scott，et al. Org： leveraging knowledge across phenotype-gene relationships[J].Nucleic Acids Research，2019，47（1）： 1038-1043.

[14] Ahmed Zeeshan，Zeeshan Saman，Mendhe Dinesh，et al. Human gene and disease associations for clinical- genomics and precision medicine research[J].Clinical and Translational Medicine，2020，10（1）：297-318.

[15] Szklarczyk Damian，Gable Annika L，Nastou Katerina C，et al.The STRING database in 2021： customizable protein–protein networks， and functional characterization of user-uploaded gene/measurement sets[J].Nucleic Acids Research，2021，49（1）： 605-612.

[16] Kalifa Manjang，Shailesh Tripathi，Olli Yli-Harja，et al. Graph-based exploitation of gene ontology using GOxploreR for scrutinizing biological significance[J]. Scientific Reports，2020，10（1）：25-29.

[17] Kanehisa Minoru，Furumichi Miho，Sato Yoko，et al. KEGG： integrating viruses and cellular organisms[J]. Nucleic Acids Research，2021，49（1）：545-551.

[18]马纳，李亚静，范吉平.槲皮素药理作用研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2018，20（8）：221-224.

[19] Bian Yifei，Lei Jiaqi，Zhong Jia，et al.Kaempferol Reduces Obesity， Prevents Intestinal Inflammation， and Modulates Gut Microbiota in High-fat Diet Mice： Kaempferol reduce inflammation and dysbacteria[J].The Journal of Nutritional Biochemistry，2021（99）：108840.

[20]陈元堃，曾奥，罗振辉，等.β-谷甾醇药理作用研究进展[J].广东药科大学学报，2021，37（1）：148-153.

[21]戴红伟，周娇.槲皮素对急性淋巴细胞白血病模型小鼠凝血功能的影响[J].中国中医急症，2018，27（6）：970-973.

[22] Jesse A Stokum，Volodymyr Gerzanich，J Marc Simard.Molecular pathophysiology of cerebral edema[J]. Journal of Cerebral Blood Flow&Metabolism，2016， 36（3）：513-538.

[23] Shah SA，Lee HY，Bressan RA，et al.Novel osmotin attenuates glutamate-induced synaptic dysfunction and neurodegeneration via the JNK/PI3K/Akt pathway in postnatalrat brain[J].Cell Death & Disease，2014（5）：1026.

[24] Yanni Lv，Wen Liu，Zhaohui Ruan，et al.Myosin IIA Regulated Tight Junction in Oxygen Glucose-DeprivedBrain Endothelial Cells Via Activation of TLR4/PI3K/Akt/ JNK1/2/14-3-3ε/NF-κB/MMP9 Signal Transduction Pathway[J].Springer US，2019，39（2）：301-319.

[25] Yule Wang，Guangxu Xiao，Shuang He，et al.Protectionagainst acute cerebral ischemia/reperfusion injuryby QiShenYiQi via neuroinflammatory networkmobilization[J].Biomedicine&Pharmacotherapy，2020 （125）：109945.

[26]張极星，张艳国，赵亮，等.急性期脑出血患者血清ICAM-1、MMP-9、TNF-α、IL-6水平和出血灶周围水肿脑组织体积的相关性[J].山东医药，2017，57（27）：58-60.

[27] Cárdenas-Rivera Alfredo，Campero-Romero Aura N，Heras-Romero Yessica，et al.Early Post-stroke Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 Hinders the Receptor 1-Dependent Neuroprotection Afforded by the Endogenous Ligand[J]. Frontiers in Cellular Neuroscience，2019（13）：270.

[28] Geiseler Samuel J，Morland Cecilie.The Janus Face ofVEGF in Stroke[J].International Journal of Molecular Sciences，2018，19（5）：1362.

[29] Moon Sunhong，Chang MiSook，Koh SeongHo，et al. Repair Mechanisms of the Neurovascular Unit after Ischemic Stroke with a Focus on VEGF[J].International Journal of Molecular Sciences，2021，22（16）：8543.

[30] Yao Yi，Zhang Yonggang，Liao Xiaoyang，et al.Potential Therapies for Cerebral Edema After Ischemic Stroke： A Mini Review[J].Frontiers in Aging Neuroscience，2021（12）：618819.

[31] Luo Zheng Wei，Ovcjak Andrea，Wong Raymond，et al. Drug development in targeting ion channels for brain edema[J].Acta Pharmacologica Sinica，2020，41（10）： 1272-1288.

[32]Robert Stephanie M，Reeves Benjamin C，Alper Seth L，et al.New drugs on the horizon for cerebral edema： what’s in the clinical development pipeline？[J]. Expert Opinion on Investigational Drugs，2020，29 （10）：1099-1105.

[33]Lee YuChen，Kao ShungTe，Cheng ChinYi.Acorus tatarinowii Schott extract reduces cerebral edema caused by ischemia-reperfusion injury in rats： involvement in regulation of astrocytic NKCC1/AQP4 and JNK/iNOS- mediated signaling[J].BMC Complementary Medicine and Therapies，2020，20（1）：374.

[34]Yang Changjun，Hawkins Kimberly E，Doré Sylvain，et al.Neuroinflammatory mechanisms of blood- brain barrier damage in ischemic stroke[J].Am J Physiol Cell Physiol，2019，316（2）：135-153.

[35]Zhang Shanshan，Gong Peng，Zhang Jiangsong，et al. Specific Frequency Electroacupuncture Stimulation Transiently Enhances the Permeability of the Blood- Brain Barrier and Induces Tight Junction Changes[J]. Frontiers in Neuroscience，2020（14）：582324.

[36]Galdamez Laura A，Brunstetter Tyson J，Lee Andrew G，et al.Origins of Cerebral Edema： Implications for Spaceflight-Associated Neuro-Ocular Syndrome[J]. Journal of Neuro-Ophthalmology： the Official Journal of the North American Neuro-Ophthalmology Society， 2020，40（1）：84-91.

[37]Fan Hong，Tang Hai Bin，Chen Zhe，et al.Inhibiting HMGB1-RAGE axis prevents pro-inflammatory macrophages/microglia polarization and affords neuroprotection after spinal cord injury[J].Journal of Neuroinflammation，2020，17（1）：295.

[38]Voet Sofie，Srinivasan Sahana，Lamkanfi Mohamed，et al. Inflammasomes in neuroinflammatory and neurodegenerative diseases[J].EMBO Molecular Medicine，2019，11（6）：e10248.

[39]馬作峰，黄密，姜瑞雪，等.固本健脑法对老年健忘大鼠海马组织中AGEs/RAGE信号通路的影响[J].中华中医药学刊，2017，35（4）：954-957.

（收稿日期：2021-07-20）