不同品种藜麦的RAPD分析

郭晓丽，吕亚慈，时丽冉，张 欢，魏 莹

不同品种藜麦的RAPD分析

郭晓丽，吕亚慈，时丽冉，张 欢，魏 莹

（衡水学院 生命科学学院，河北 衡水 053000）

藜麦蛋白含量高，营养价值丰富，受到国内外学者的广泛关注。为进一步研究藜麦种质资源的遗传特性，本实验以9个藜麦品种为材料，采用46个随机引物对不同藜麦品种的基因组DNA进行RAPD分析。实验结果表明：通过PCR扩增，一共获得了372条扩增条带，其中多态性条带134条，多态性比例为36%。由聚类分析发现9个藜麦品种之间的遗传相似系数在0.530～0.804之间。同时，9个藜麦品种可以划分为4类。第一类为QA13-8和SCL；第二类为QA13-13-1-23，它与其他品种的遗传距离较远；第三类为黄藜1号和土黄藜；第四类为红藜、黄藜、YY-6-6-Z、QA13-8-1-15。

藜麦；基因组DNA；RAPD；聚类分析

藜麦（Chenopodium quinoa Wild），又名南美藜、藜谷等，是南美洲安第斯山一种传统的农作物。藜麦的蛋白质含量高，富含钙磷铁等元素，有“养分黄金”和“有机谷类之王”等美称[1]。藜麦不但营养成分含量高，还有许多生物学功效。比如藜麦含有丰富的维生素，在预防衰老、抗氧化等方面具有突出作用[2]。胡一晨等通过研究发现藜麦中的非淀粉类多糖可以有效地起到降血糖、降血脂作用[3]。近年来藜麦蕴含的价值激发了研究者的极大兴趣，目前藜麦的研究主要集中在其生物学特征、化学组成成分、生理学功效等方面[4]。因为藜麦种类较多，要想通过传统形态学标识标记等方法来进行藜麦的选种育种存在一定的困难，而分子标记技术是目前最理想的标记手段，分子标记手段克服了传统遗传研究方法程序繁杂和易受外界因素干扰等缺点而使其在遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等方面得到普遍的应用，展现出良好的应用前景。

随机扩增多态性DNA（RAPD）技术是1990年发明的一种建立于PCR基础上的可以对未知序列的基因组进行多态性分析的分子标记技术[5]。RAPD技术快捷便利，不需要经过分子杂交这一操作，并且随着反应体系的不断优化和检测手段的相应进步，加之目前RAPD方法可大规模自动化分析样品，RAPD辅助选择育种和其他相关应用研究更为深入彻底，现已广泛应用于小麦[6]、玉米[7]、水稻[8]等作物的系谱分析、品种鉴定及亲缘关系分析。

本研究以9个不同品种藜麦为材料，采用46种随机引物，分别对不同藜麦基因组DNA进行RAPD分析，进而分析藜麦不同品种间的遗传关系，从而为藜麦种质资源的开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

9个藜麦品种分别为：QA13-8、QA13-13-1-23、SCL、黄藜1号、土黄藜、红藜、黄藜、YY-6-6-Z、QA13-8-1-15（依次编号为1—9），由张家口市农科院提供。

1.2 方法

1.2.1 植株培养

挑选不同品种藜麦种子各50粒，用0.1%氯化汞消毒10 min，经去离子水冲洗干净后，放于装满蛭石的器皿中，然后再铺盖一层蛭石并加入适量蒸馏水，放在通风良好的环境中进行培养并定期浇灌营养液。待藜麦植株生长到10 cm左右，选取幼嫩的叶片，放入－70 ℃的冰箱中保存备用。

1.2.2 基因组DNA提取

采用SDS法提取藜麦基因组DNA[9]。

1.2.3 基因组DNA检测

通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测，测定不同品种藜麦基因组DNA的浓度和纯度，并将所有样品的质量浓度稀释至50 ng/uL备用。

1.2.4 RAPD-PCR扩增

采用10 uL 的PCR反应体系为：10*Buffer 1 uL；Mg2+1 uL；dNTP 1 uL；Primer 0.5 uL；Taq E 0.1 uL；DNA（50 ng/uL）2 uL；H2O 4.4 uL。扩增步骤：94 ℃，5 min；（94 ℃，1 min；72 ℃，1.5 min），45个循环；72 ℃，5 min；4 ℃保存备用。RAPD扩增产物用质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像仪上进行扫描拍照。

1.2.5 数据统计分析

采用Excel软件整理记录最初的条带数据，统计出每个引物所扩增出的总条带数和多态性条带数，从而算出多态性位点的百分比。采用NTSYS 2.10e软件进行聚类分析来判定不同品种藜麦间的遗传关系。

2 结果与分析

2.1 不同品种藜麦基因组DNA的检测

通过琼脂糖凝胶电泳对9种不同品种藜麦的基因组DNA进行检测，如图1所示，所提取的藜麦基因组DNA条带清晰完整，DNA一致性较好，可用于后续PCR扩增。

注：从左到右依次为品种1至9。

2.2 不同品种藜麦RAPD-PCR分析

以不同品种藜麦的基因组DNA为模板，利用46个随机引物进行PCR扩增，扩增部分结果如图2、图3所示。由电泳结果可以看出，不同引物对藜麦基因组DNA的扩增结果差异较大，其中除引物S65和S81未扩增出条带外，其他引物均可扩增出不同数量的条带。通过对扫描后的电泳图进行统计分析，在46个引物扩增出的条带中，引物S33、S62、S64、S82、S84、S86扩增出的特异性条带所占比例最高，均为100%。引物S25、S26、S28、S32、S69扩增出的特异性条带比例高于50%。S35、S36、S39、S40、S65、S67、S70、S74、S76、S77、S81、S87、S88、S89没有得到特异性条带。46个随机引物S25-S40、S61-S90总共扩增出372条带，其中多态性条带134条，多态性比例为36%。

2.3 不同品种藜麦的聚类分析

使用NTSYS软件对9个不同藜麦品种的扩增图谱进行处理，再运用UPGMA进行聚类分析。由聚类图（图4所示）可以看出，本试验9种藜麦间的遗传相似系数为0.530～0.804，这表明不同品种藜麦间存在一定的遗传差异。9个藜麦品种在遗传相似系数为0.726处可划分为4类。第一类为QA13-8和SCL，品种的遗传相似系数为0.761。第二类为QA13-13-1-23。它与其他品种的遗传距离较远。第三类为黄藜1号和土黄藜。品种的遗传相似系数为0.783。第四类为红藜、黄藜、YY-6-6-Z、QA13-8-1-15。其中，红藜和黄藜的亲缘关系比较近，YY-6-6-Z和QA13-8-1-15的亲缘关系比较近，它们之间的遗传相似系数均为0.804。同时，藜麦品种QA13-13-1-23和QA13-8-1-15之间的遗传距离最远（0.370），红藜和黄藜、黄藜和YY-6-6-Z、YY-6-6-Z和QA13-8-1-15之间的遗传距离最近（0.804）。这说明QA13-13-1-23与其他品种间的基因组差异较大，可在藜麦杂交育种中优先考虑作为候选品种。

注：左边为S30的扩增结果，右为S29的扩增结果

注：左边为S90的扩增结果，右为S89的扩增结果

图4 9个藜麦品种的聚类分析图

3 讨论

研究藜麦的遗传多样性对藜麦选种育种意义非凡，由于种质流动性加快，种质资源研究也随之变得复杂，使用传统的方法来分析种质资源有一定的弊端[10]。分子标记技术从DNA水平上揭示了品种间的差异性和相关性，克服了传统方法分析种质资源的困难。至今，关于应用RAPD技术来分析藜麦遗传多样性的研究报道较少。

通过对9个藜麦品种的基因组DNA利用46个随机引物进行RAPD分析，由扩增结果可以明显看出，46个引物中44个引物均可扩增出条带，其中藜麦品种1、2、3、5、8扩增出的条带一致性较高，品种4、7、9的条带吻合性较高，而品种6与其他品种间的一致性存在较大差异。由46个引物得到的聚类图可以看出：藜麦品种1、3比较接近，品种4、5的亲缘关系比较近，品种6、7、8、9的亲缘关系最近，而品种2与其他品种间的遗传关系相对较远。由以上结论可以得出：使用的随机引物不同，覆盖的基因组也就不同，通过分析电泳条带得到的结果也就会有差异。

本试验进行遗传分析发现9个品种间的遗传相似系数为0.530～0.804，亲缘关系比较近。同时，藜麦品种QA13-13-1-23和QA13-8-1-15之间的遗传距离最远（0.370），红藜和黄藜、黄藜和YY-6-6-Z、YY-6-6-Z和QA13-8-1-15之间的遗传距离最近（0.804）。这表明不同地区不同品种的藜麦具有一定的相似性。此外，本实验张共扩增出372条带，其中134条特异性条带，多态性明显要比宋娇的研究要低[11]。这可能与我们做试验时用的藜麦种类、数量少，引物样本不够大等有关。为了使实验数据更具科学性，建议在以后的研究中，可适当增加实验材料的数量、种类及随机引物的数量。

此外，本试验仅使用RAPD分子标记方法对藜麦的遗传多样性进行了研究，宋娇使用了形态学标记和SSR分子标记两种方法对收集的藜麦做了遗传多样性评价，都得到了聚类树图，从侧面反映出这两种标记方法都适用于研究种质资源的遗传多样性[11]。形态学标记和分子标记技术各有利弊，选择合适的方法可以有效地揭示藜麦种质资源间的本质差别，因此结合两种方法进行研究可以更准确、更全面地描述其遗传多样性。

[1]Vega-Gálvez A, Miranda M, Vergara J, et al. Nutrition facts and functional potential of quinoa (Chenopodium quinoa willd.), an ancient Andean grain: a review[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2010,90(15):2541-2547.

[2] 向卓亚,邓俊琳,陈建,等.藜麦体外模拟消化过程中酚类物质含量及抗氧化活性的变化[J].中国食品学报.2021, 21(8):283-290.

[3] 胡一晨,赵钢,秦培友,等.藜麦活性成分研究进展[J].作物学报,2018,44(11):1579-1591.

[4] 杨发荣,黄杰,魏玉明,等.藜麦生物学特性及应用[J].草业科学,2017,34(3):607-613.

[5] Hawker J S, Jenner C F. High temperature affects the activity of enzymes in the committed pathway of starch synthesis in developing wheat endosperm[J]. Aust J PI Physiol.1993.20(2):197-209.

[6] 郑爱泉,张宝林.DNA分子标记技术及其在小麦遗传多样性研究中的应用[J].安徽农业科学,2015(17):40-42,144.

[7] 张正,连灵燕,王高鸿,等.分子标记技术在玉米育种中的应用[J].生物技术进展,2015,5(4):259-264.

[8] 王彤彤.水稻分子标记辅助育种研究进展[J].黑龙江农业科学,2012(2):142-145.

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[11] 宋娇.藜麦种质资源遗传多样性研究及藜麦品种(系)变异率分析[D].西宁:青海大学,2018.

RAPD Analysis of Different Varieties of Quinoa

GUO Xiaoli, LV Yaci, SHI Liran, ZHANG Huan, WEI Ying

(College of Life Science, Hengshui University, Hengshui, Hebei 053000, China)

Quinoa has high protein content and rich nutritional value, which has been widely studied by scholars. In order to understand the genetic characteristics of quinoa germplasm resources, nine different varieties of quinoa were taken as experimental materials. We used 46 random primers to perform RAPD analysis on the genomic DNA of different quinoa varieties. Through PCR amplification, we obtained 372 bands, among which 134 were polymorphic, with a polymorphism ratio of 36%. According to the clustering analysis, the genetic similarity coffficient of these varieties was between 0.530 and 0.804. These nine quinoa varieties can be grouped into 4 categories. The first category includes QA13-8 and SCL.The second group is QA13-13-1-23, which is genetically distant from other breeds. Yellow quinoa1 and yellowish-brown quinoa are the third category. The last category includes red quinoa, yellow quinoa, YY-6-6-Z and QA13-8-1-15.

quinoa; genomic DNA; RAPD; cluster analysis

10.3969/j.issn.1673-2065.2022.04.006

郭晓丽（1977－），女，河北邯郸人，副教授，理学博士；

吕亚慈（1982－），女，河北安平人，讲师。

河北省高等学校科学技术研究项目（ZC2022045）；衡水学院校级科研项目（2022ZR11）

Q945

A

1673-2065(2022)04-0029-04

2022-03-10

（责任编校：李建明 英文校对：李玉玲）