耿马甘蔗白叶病植原体昆虫介体调查与检测

李文凤，王晓燕，仓晓燕，张荣跃，单红丽，卢文洁，王长秘，尹 炯，黄应昆

（1云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，云南开远 661699；2云南省农业科学院农生物技术与种质资源研究所，昆明 650205）

0 引言

甘蔗白叶病是由16S rXI 组植原体引起的检疫性甘蔗病害[1]。甘蔗白叶病1954年在泰国首次发现[2]，现今在印度、巴基斯坦、越南等东南亚植蔗国家普遍发生、危害严重，给当地造成巨大经济损失[3-5]。2013 年Li 等[6]首次检测确定云南保山存在甘蔗白叶病，随后云南临沧和普洱主产蔗区也相继发现甘蔗白叶病[7-9]，其暴发流行趋势明显，已严重影响到云南蔗糖产业高质量发展。

甘蔗属宿根栽培无性繁殖作物，甘蔗白叶病植原体主要由蔗种带病传播，在台湾和泰国，还可通过细针叶蝉(Matsumuratettix hiroglyphicus)和条纹闭颜叶蝉(Yamatotettix flavovittatus)进行田间自然传播，其他叶蝉介体还没有被证实[10-13]。植原体的传毒媒介及其机理是防病的基础，目前云南蔗区甘蔗白叶病植原体的传毒媒介及其机理尚不明确，不利于此病害的科学防控。

2019年，对甘蔗白叶病发病最严重的云南耿马蔗区植原体昆虫介体进行调查，共采到昆虫介体14份进行种类鉴定。参照Hanboonsong等[11]的方法分别提取昆虫介体DNA，使用植原体通用引物对P1/P7[14]和R16F2n/R16R2[15]进行Nest-PCR检测、克隆、测序，以分析明确云南耿马蔗区甘蔗白叶病植原体昆虫介体及优势种群，旨在为云南甘蔗白叶病有效防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 昆虫介体调查采集

2019年5—6月，对甘蔗白叶病发病最严重的云南耿马贺派和芒翁蔗区植原体昆虫介体进行调查（北纬13°29′—23°36′，东经99°22′—99°45′，海拔1100.00～1300.00 m）。选择感病品种‘粤糖60 号’、‘新台糖25号’、‘盈育91-59’、‘粤糖93-159’、‘新台糖22号’发病严重地块，采用寻集法和扫网法重点调查采集叶蝉、飞虱等植原体昆虫介体，将采集到的昆虫介体及时移入盛有75%酒精的离心管中保存，并记录采集时间、地点，带回实验室进行种类鉴定。

1.2 DNA提取

参照Hanboonsong 等[11]的方法，使用动物基因组DNA提取试剂盒（生工生物公司）提取昆虫介体DNA。

1.3 Nest-PCR检测

采用植原体通用引物对为P1/P7[14](P1：5’-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3’，P7：5’-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3’) 和 R16F2n/R16R2[15](R16F2n：5’-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3’，R16R2：5’-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3’)，预期扩增产物长度为1240 bp，以抽提的昆虫介体DNA 为模版，参照张荣跃等[8]的方法对各样品进行Nest-PCR检测。

1.4 测序

随机选择阳性扩增产物，使用全式金回收试剂盒回收目的片段，并进行连接转化、克隆、测序。所得序列在GenBank 中作BLAST 检索对比，使用DNAMAN v6.0分析核苷酸序列。

2 结果与分析

从甘蔗白叶病发病最严重的云南耿马蔗区采集到14 份昆虫介体样品，经实验室种类鉴定为大青叶蝉Tettigoniella viridis6 份（其中若虫2 份）和条纹平冠沫蝉Clovia conifer8份（其中若虫2份）（表1）。

如表1、图1所示，14份昆虫介体样品中2号、3号、5号、8号、9号、10号共6份样品为阳性，其余8份样品为阴性。其中，10号样品（大青叶蝉若虫）巢式PCR扩增条带粗且明亮样品中有高含量甘蔗白叶病植原体为强阳性，3号、9号样品（大青叶蝉若虫、成虫）和2号、5号、8号样品（条纹平冠沫蝉若虫、成虫）巢式PCR扩增条带细且弱暗样品中有低含量甘蔗白叶病植原体为弱阳性。

图1 14份昆虫介体样品甘蔗白叶病巢式PCR检测电泳图

表1 14份昆虫介体样品甘蔗白叶病巢式PCR检测结果

测序结果显示，2 号和10 号样品2 个阳性扩增产物片段大小为1247 bp，序列间的核苷酸一致性为100%。BLASTN分析结果表明，本研究获得的2条序列（Genbank 登录号MT649297 和MT649298）与云南临沧和斯里兰卡甘蔗白叶病植原体分离物16S rRNA基因序列（Genbank 登录号KR020691 和MN174860）的核苷酸序列一致性为100%。

3 结论与讨论

国内目前已报道的与植原体相关的病害有100余种[16]，甘蔗白叶病是近年云南蔗区快速蔓延开来的植原体新病害，现已严重影响到云南甘蔗产业提质增效和蔗农增收。自然条件下，叶蝉、飞虱、木虱、蚜虫、粉虱以及椿类等是植原体的传毒媒介[17-18]。在中国台湾和泰国，细针叶蝉(Matsumuratettix hiroglyphicus)和条纹闭颜叶蝉(Yamatotettix flavovittatus)自然传播甘蔗白叶病植原体，其他叶蝉介体尚未得到证实[11-14]。研究表明喷施杀虫剂对降低SCWL 的发生率效果不理想[19-21]，甘蔗种茎用热水处理不能有效清除种茎中的SCWL植原体[22]。而通过组织培养繁育健康甘蔗苗被认为是消除甘蔗体内SCWL植原体最有效的方法，大量推广使用甘蔗无病组培苗及其种茎控制SCWL 在泰国收到很好的效果[23]。目前云南蔗区甘蔗白叶病植原体传毒媒介及其机理不明，不利于此病害的科学防控。本研究结果显示，从甘蔗白叶病发病最严重的云南耿马蔗区采集到的大青叶蝉(T.viridis)和条纹平冠沫蝉(C.conifer)2 种昆虫介体均被检测为阳性，是甘蔗白叶病植原体的自然携带者，说明2 种叶蝉可能为甘蔗白叶病植原体潜在昆虫介体，而10号样品大青叶蝉若虫巢式PCR 扩增条带粗且明亮样品中有高含量甘蔗白叶病植原体呈强阳性，初步确定为优势种群，有待对其进一步作获毒、持毒及传毒期和传毒方式、传毒效率等传毒特性测试验证。本次调查，从甘蔗白叶病发病最严重的云南耿马蔗区仅采到昆虫介体14份样品，种类单一、数量极低，这可能与多年来国内蔗区推广应用吡虫啉、噻虫嗪及其复配制剂有效防控甘蔗绵蚜、叶蝉、蓟马等虫媒介体有关[24-25]，这在一定程度上也减缓了甘蔗白叶病植原体的田间自然传播。研究结果丰富了甘蔗植原体病害相关理论和技术基础，有助于制定适用于甘蔗白叶病的综合防控措施。本研究仅对云南耿马局部蔗区和5—6月甘蔗生长早期进行调查，存在调查范围和时期及重复性不足，应扩大调查范围、延长调查时期、增加调查次数，并对虫媒介体优势种群进行

获毒、持毒及传毒期和传毒方式、传毒效率等系统性传毒特性测试，以期全面明确中国甘蔗白叶病植原体虫媒介体及传毒特性，揭示国内甘蔗白叶病主要发生区虫媒介体对病害发生流行的影响。

甘蔗白叶病是可造成甘蔗绝产绝收的一种植原体病害[1]。目前云南蔗区甘蔗白叶病植原体传播方式主要是带毒蔗种[26]，主栽品种种茎的SCWL 阳性检出率均在90%以上[27]，在田间还存在大青叶蝉和条纹平冠沫蝉自然传播，准确选择无病健康蔗株作种苗和有效防控虫媒介体尤为重要。建立甘蔗无病健康种苗繁育基地，加强甘蔗白叶病监测，及时销毁病株，病田避免宿根连作；同时，从切断植原体自然传播途径入手，及时杀灭蔗园中的叶蝉等昆虫传播介体。