褪黑素对羊精液冷冻后精子运动能力和产羔率的影响

马文奎，吴 昊，阎来庆，关盛宇，徐 尚，周 强，钱立华，郭小凯，刘 强，刘奋泽，阿布力孜·吾斯曼，刘国世*

（1.中国农业大学 动物科学技术学院，北京 100193；2.新疆农业大学 动物科学学院，乌鲁木齐 830052；3.内蒙古金草原生态科技集团有限公司，内蒙古 巴彦淖尔 015115）

湖羊是世界著名的多胎绵羊品种，也是我国一级地方保护畜禽品种和唯一的白色羔皮羊品种，具有适应能力强、性成熟早、繁殖率高、多羔等优良性状。近年来随着畜牧业集约化、规模化的快速发展，人工授精技术在全世界得到广泛应用，为提高养殖生产效率，优质种公羊的精液需求量也在逐年增加。精液冷冻保存不仅可以延长优质精液保存时间，还能提高优秀种公羊的种用价值和利用率。

褪黑素（melatonin，MT）是一种主要由松果腺分泌的神经激素，具有多种生物学功能，如调节睡眠、抗衰老、抗凋亡、抗氧化应激、提高免疫力等。褪黑素在精液冷冻过程中通过清除精子细胞内过量的活性氧，提高冻后精子质量。在鸡精液冷冻试验中发现，添加0.25 mg／mL褪黑素可以显著提高冷冻精液解冻后精子活力、质膜完整率和顶体完整率，并伴随着解冻后精液超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性上升及丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）水平的降低。在小鼠精液冷冻试验中发现，补充0.125 mg／mL褪黑素可减少氧化损伤和细胞凋亡，精子活力提高。也有研究表明，添加褪黑素对公猪精子特性及后续体外胚胎发育具有改善作用，使卵母细胞的囊胚发育速率显著提高。与褪黑素有关的多数试验集中在褪黑素浓度处理上，且只分析了冷冻精液的品质，并没有相关的输精试验。为此，本试验以湖羊为研究对象，通过在精液冷冻液中添加褪黑素，探究褪黑素对冷冻精液解冻后精子运动能力、妊娠率和产羔性能的影响，为褪黑素在冷冻精液中的使用奠定基础，现报道如下。

1 材料

1.1 试验动物

体质健壮的2岁湖羊种公羊4只，体重为80～90 kg，无繁殖疾病，膘情良好；初产湖羊母羊100只，作为人工授精受体，体重为40～45 kg。湖羊公羊、母羊均由内蒙古巴彦淖尔市金草原生态科技集团有限公司提供。

1.2 药品

孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG，批号为191222）、促排3号（A3），由宁波三生药业有限公司生产；阴道栓、维生素A-D（批号为180601），均购自北京绿欣康农牧科技有限公司。

1.3 主要试剂

精液冷冻稀释液Ⅰ液（TYYDJSJ-400-Ⅰ，货号为TYXS20）、精液冷冻稀释液Ⅱ液（TYYDJSJ-400-Ⅱ，货号为TYXS20），均购自北京田园奥瑞生物科技有限公司；75%乙醇、碘酒、新洁尔灭等均为国产，市购；新鲜鸡蛋，市购。

1.4 主要仪器和用品

冰箱（型号为BCD-182LTMPA），购自青岛海尔股份有限公司；水浴锅（型号为DZKW-D-2），购自北京市光明医疗仪器有限公司；精液质量分析系统（型号为CASAS-QH-Ⅲ），购自清华同方股份有限公司；B超仪（型号为RKU10），购自徐州市凯信电子设备有限公司；冷冻泡沫箱、0.25 mL细管码架及搓板，北京田园奥瑞生物科技有限公司自主研发；液氮罐、10 mL／50 mL注射器、载玻片、盖玻片、红宝石计数板、大镊子、吸水纸、记号笔、10 μL／200 μL／1 000μL枪头、1.5 mL离心管、剪刀，均为国产，市购；采精器（假阴道）和输精枪，内蒙古巴彦淖尔市金草原生态科技集团有限公司提供；10μL／200μL／1 000μL（Eppendorf）移液器、显微镜，市购。以上仪器和用品均由中国农业大学动物科学技术学院动物遗传育种与繁殖重点实验室提供。

2 方法

2.1 仪器和用品的准备

通过空调将室温控制在25℃左右，水浴锅调至30～35℃。提前备好注射器、离心管、搓板、码架、记号笔等器材。开机预热显微镜。

2.2 稀释液的配制和预热

按照羊冷冻稀释液说明书配制稀释液。每瓶80 mL稀释液加蛋黄20 mL，大约需要取新鲜鸡蛋2个；用75%乙醇消毒、擦净鸡蛋表面；打开蛋壳，漏掉蛋清，将蛋黄倒在吸水纸上，轻轻滚动蛋黄，将蛋清擦净；用10 mL注射器抽取10 mL蛋黄加入基础液中，另用10 mL注射器取6.5 mL甘油加到稀释液中；将冷冻液分成4个组，褪黑素1×10mol／L（1组）、1×10mol／L（2组）、1×10mol／L（3组），对照组不添加褪黑素；反复颠倒混匀后，将稀释液放入水浴锅中预热；未用完的稀释液置冰箱冷藏保存，备用。

2.3 采精

为诱导公羊爬跨，刺激公羊性欲，采精开始前寻找一只当日发情母羊，保定在采精架上，备用；用75%乙醇对假阴道和集精杯进行清洗消毒，最后用生理盐水冲洗干净，直至75%乙醇被完全冲洗干净，假阴道中装满用温度计调试好的38℃温水；4只公羊依次进行采精，采精前需要用卫生纸将阴茎部位擦拭干净。采精时需注意保温并避免污染，做好采精量、颜色等记录。

2.4 精液分析与稀释

将精液置于水浴锅中保温；根据集精杯刻度读取采精量，或者用10 mL注射器量出采精量；按精液、稀释液1∶3比例向精液中缓慢加入稀释液，边加边混匀；然后取稀释后精液200μL加到1.5 mL离心管中，再加入800μL稀释液，混匀；取3μL左右精液滴到精液质量分析系统专用载玻片上，盖好盖玻片；用显微镜低倍镜找到精子，然后换到适宜倍数物镜下（20×），用精液质量分析系统检测精子活力、平均曲线运动速度（VCL）、平均直线运动速度（VSL）、平均路径速度（VAP）、精子平均侧摆幅度（ALH）、直线运动精子活率，检测3～7个视野，取平均值。若精液质量太差，精子活力低于60%则不进行冷冻。若精液质量较好、精子活力大于60%则根据精子密度检测结果将精液进一步稀释为1亿／mL。

2.5 平衡

封好的精液放在码架上和搓板等一并放入4℃低温操作柜，平衡3～4 h。

2.6 灌装封口

稀释后的精液，操作人员用口吸入0.25 mL冷冻管灌装，用封口粉处理封口，用无菌纱布擦去多余封口粉，最后在细管上标注羊号及冷冻日期。

2.7 冷冻

提前将液氮罐中的液氮倒在冷冻泡沫盒中，待平衡至4℃时，码架和搓板等一并放入熏蒸箱中熏蒸10 min，熏蒸结束时将码架和搓板取出，随后将精液细管浸入液氮中。

2.8 装袋保存

经检测合格的细管冻精装入拇指管，然后装入纱布袋，放入液氮罐保存。注意防止人员冻伤，做好标签，及时添加液氮。

2.9 精液品质的检测

将水浴锅水温调至37℃。用镊子取一支冷冻好的细管精液，迅速放入水浴锅中解冻至少30 s，擦净管外的水，然后用剪刀剪开细管封口端，滴一滴精液到精液质量分析系统载玻片上，盖好盖玻片，在显微镜下观察活力。利用计算机辅助精液质量分析系统测定精子运动指标，包括精子活力、VCL、VSL、VAP、ALH、直线运动精子活率。

2.10 母羊处理

同期发情埋栓前，将100只母羊随机分为4组：褪黑素1×10mol／L组（1组），24只母羊；褪黑素1×10mol／L 组（2 组），24 只母羊；褪黑素1×10mol／L组（3组），23只母羊；对照组22只母羊。一组羊一个圈舍。共计埋栓100只，有7只掉栓。

2.10.1 母羊同期发情处理 使用硅胶栓（CIDR）+PMSG+促卵泡素释放激素（LRHA3）法对湖羊进行同期发情处理。在发情周期内随机选取1天植入CIDR栓（含30 mg孕酮），将其定为第0天，第13天撤去CIDR，撤栓时注射PMSG，剂量范围为250～350 IU，24 h后用公羊试情，记录发情时间。

2.10.2 子宫颈口输精 首先将细管冻精取出，置于空中解冻15 s，然后放于37℃水浴中1 min，用卫生纸擦干冷冻管表面水分，将封口粉一端对准15 mL离心管中，另一端用剪刀剪开。取1滴精液于载玻片上进行运动能力检测。冻后精子活力在50%左右的放于恒温箱中，备用。将经过同期发情处理且确认发情的各组母羊进行人工保定。将精液输至过子宫颈口第一褶皱处。每只母羊输精2支解冻精液，输精时同时使用A3 1 mL，在输精12 h后进行复配。输精完成做好标记。在输精33 d后进行妊娠检查。

2.11 母羊妊娠率、产羔率和羔羊成活率的测定

输精后33天采用B超仪进行妊娠检查，记录妊娠母羊数，计算妊娠率。约150 d后产羔，统计产羔数和羔羊成活数，计算产羔率、羔羊成活率。

2.12 数据的统计分析

精液冷冻前后相关指标检测重复3次，数据使用SPSS 25.0软件进行卡方检验（Chi-Square Test）。测定数据以“平均值±标准误”表示。

3 结果与分析

3.1 不同个体雄性湖羊鲜精理化特性分析

4只湖羊公羊采精3次，每次均为乳白色，冻前精液的采精量、密度和精子活力均无显著差异（P＞0.05），见表1。

表1 不同个体雄性湖羊鲜精理化特性分析Tab.1 Analysis of physical and chemical characteristics of fresh sperm of different male Hu sheep

3.2 不同浓度的褪黑素对湖羊精液冷冻前后精子活力及运动能力的影响

使用精液质量分析系统对湖羊精液冷冻前后进行运动能力检测，结果表明：各组精子活力、VCL、VSL、VAP和直线运动精子活率均显著低于冻前（P＜0.05）；1组精子活力显著高于3组和对照组（P＜0.05），VCL显著高于对照组（P＜0.05）；2组精子活力、VCL、VSL、直线运动精子活率均显著高于1组、3组和对照组（P＜0.05），VAP、ALH显著高于对照组（P＜0.05）；3组VCL显著高于对照组（P＜0.05）。说明2组褪黑色素剂量对精子冷冻后的活力、VCL、VSL、VAP、ALH和直线运动精子活率的保护效果较好。见表2。

表2 冷冻液中添加褪黑素后对冷冻精液的精子活力及运动能力的影响测定结果Tab.2 Viability and exercise ability of Hu sheep after freezing by adding melatonin to the frozen semen

3.3 冷冻稀释液中添加褪黑素对湖羊冷冻精液子宫颈口输精妊娠率的影响

利用子宫颈口输精技术对93只同期发情湖羊母羊进行子宫颈口输精，在配种后33天对配种妊娠率进行统计，结果表明：1组与其他组妊娠率差异不显著（P＞0.05）；2组（70.83%）妊娠率显著高于3组（40.91%）和对照组（39.13%，P＜0.05），与1组（45.83%）相比差异不显著（P＞0.05）。说明2组褪黑色素剂量对精子冷冻后子宫颈口输精妊娠率有较好效果。见表3。

表3 冷冻液中添加褪黑素后湖羊冷冻精液子宫颈口输精妊娠率测定结果Tab.3 Pregnancy rate by cervical insemination of frozen semen of Hu sheep after adding melatonin to semen cryo-diluent

3.4 湖羊冷冻精液子宫颈口输精对产羔率和成活率的影响

利用子宫颈口常规输精技术对93只同期发情湖羊母羊进行输精，配种后对产羔率进行统计，结果表明：1组产羔率为209.09%，羔羊成活率为91.30%；2组产羔率为217.65%，羔羊成活率为94.59%；3组产羔率为211.11%，羔羊成活率为89.47%；1，2，3组产羔率和羔羊成活率与对照组（200.00%）相比差异不显著（P＞0.05）。说明精液冷冻液中添加褪黑素对母羊产羔率和羔羊成活率没有显著影响。见表4。

表4 湖羊冷冻精液子宫颈口输精产羔率和羔羊成活率测定结果Tab.4 Lambing rate and survival rate of frozen semen in cervical orally insemination of Hu sheep

4 讨论与结论

4.1 冷冻液中添加褪黑素对精子活力的影响

褪黑素已在精液冷冻过程中广泛使用。郭良勇等在湖羊冷冻液中添加不同浓度（10，20，30 mg／mL）褪黑素，结果表明：褪黑素20 mg／mL组顶体膜完整率极显著提高，谷胱甘肽（GSH）含量极显著升高，丙二醛（MDA）含量极显著降低。本试验最佳褪黑素浓度（1×10mol／L，换算后相当于2.3 mg／mL）低于郭良勇等的试验浓度。山羊冷冻稀释液添加1×10mol／L褪黑素能够改善解冻后精液品质。宋博宇在精液低温保存过程中发现，褪黑素添加浓度为20 mg／L时，精液保存5 d后精子活率、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性显著高于对照组。同样，吴美灵利用褪黑素及其代谢产物 清除活性氧，结果表明：1×10mol／L 和1×10mol／L褪黑素能显著提高安格斯牛的精子活力、质膜和线粒体膜完整性。本试验的试验动物（湖羊）和添加浓度（1×10mol／L、1×10mol／L、1×10mol／L）与吴美灵选取的试验动物（安格斯）和浓度（1×10mol／L、1×10mol／L）不一致，但都通过添加褪黑素使精子活力提高。李方舟等发现，褪黑素能够提高低温保存的羊精液品质和存活时间。吴大平的研究表明，在水牛精液冷冻稀释液中添加褪黑素可以降低精子畸形率，提高冻后精子活力。褪黑素可以通过激活体内过氧化物酶而间接发挥抗氧化作用，以减少精子活性氧的产生，从而起到提高精子活力的作用。杨宝卫等研究发现，褪黑素能有效提高猪精子活力。以上研究中的试验条件和试验动物与本试验不同，但结果一致。

4.2 冷冻液中添加抗氧化剂对妊娠率的影响

赵霞等未在蒙古羊冷冻精液中添加任何抗氧化剂，输精后结果表明，利用腹腔镜输精法的受体受胎率平均值最高（60.20%）；其次为过子宫颈第二到第三皱褶（3～4 cm）输精，受体受胎率平均值为58.3%；过子宫颈第一皱褶（1～2 cm）输精法和常规输精法的受体受胎率平均值相近，分别为37.5%和36.30%。本试验中，冷冻液中添加褪黑素1×10mol／L后输精，母羊妊娠率（70.83%）高于赵霞等采用内窥镜在子宫颈口输冷冻精液的效果（37.5%）。这可能是由于试验动物不同、在未添加任何抗氧化剂的情况下使得精子活力较低，妊娠率有所下降；本试验输精过程中采用的是过子宫颈口第一褶皱，对照组妊娠率（39.13%）略高于赵霞等常规输冷冻精液的结果（36.30%）。这可能是由于冷冻过程中操作流程、试验动物不同导致。不同动物精子对降温的敏感程度不同，而羊精子对低温环境更加敏感。一般情况下活力不超过50%，这是导致冷冻精液人工授精受胎率不高的原因之一。羊冷冻精液保存过程中的关键问题是人工在冷冻—解冻—输精操作误差或通过寻找酶类抗氧化剂和非酶类抗氧化剂等减少降温过程中对精子造成的损伤，因此寻求更好的保护剂提高羊精液冷冻保存后的精子存活率和受胎率，对羊产业发展具有重要意义。

本试验结果表明：冷冻稀释液中添加褪黑素1×10mol／L、1×10mol／L、1×10mol／L均有利于提高冷冻精液解冻后的运动能力和解冻后输精的妊娠率，其中添加1×10mol／L的效果最好。