D-核糖对阿霉素诱导心脏毒性的保护作用及机制研究

肖爱爱，王雪艳，温 敏, ，王正平,2,3,

（1.聊城大学生物制药研究院，山东聊城 252000；2.聊城高新生物技术有限公司，山东聊城 252000；3.海门品尚医药科技有限公司，江苏南通 226133）

D-核糖（D-ribose，DR）是一种五碳醛糖，天然存在于所有生命细胞中，参与三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）的合成，在能量代谢中起重要作用[1]。D-核糖作为磷酸戊糖途径的产物，有助于磷酸戊糖途径的循环，增强氧化酶活性，快速清除自由基，提高机体氧化系统的防御能力[2−3]。目前，D-核糖作为一种新食品原料，已广泛应用于饮料、能量棒等多种食品加工中[4]。袁保辉等[5]和张振刚等[3]的研究发现，补充D-核糖可以改善疲劳模型小鼠的心脏损伤，延长小鼠游泳时间并促进疲劳小鼠体能恢复；临床研究表明，D-核糖对慢性疲劳综合征[6]、纤维肌痛[7]和充血性心力衰竭患者舒张功能障碍[8]等具有一定的改善作用。此外，已有研究表明：补充D-核糖可以改善大鼠心肌缺血再灌注损伤[9−10]。以上研究结果表明，D-核糖具有一定的心脏保护作用。

近年来，癌症的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，严重危害人类的健康[11]。阿霉素（Doxorubicin，DOX）作为蒽环类化疗药物的代表，是目前临床最常用的高效广谱抗肿瘤药物之一，但因严重的心脏毒性限制了其应用[12]。研究表明，口服D-核糖对心脏具有保护作用，并能减轻顺铂介导的肾脏损伤[13]。然而，尚未见D-核糖对DOX 心脏毒性保护作用的报道。因此，本研究通过采用单次腹腔注射大剂量阿霉素（15 mg/kg）建立DOX 急性心脏毒性小鼠模型，通过检测血清生化指标和心脏组织病理变化评价D-核糖对DOX 心脏毒性的保护作用，并进一步通过蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白的表达揭示其潜在的分子机制，以期为DOX 心脏毒性的防治研究提供一定的参考和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

40 只ICR 雄性小鼠，8 周龄、体重25～30 g 济南朋悦实验动物繁育有限公司（中国济南），实验动物生产许可证号：SCXK 鲁2019-0003。所有小鼠均于温度（23±2）℃、湿度（45%±10%）、12 h 光照/12 h 黑暗循环的环境下饲养，自由进食和饮水。动物实验经聊城大学伦理委员会批准（批准号20200803）。

D-核糖 江西诚志生物工程有限公司；盐酸阿霉素（纯度≥98%，货号：D807083） 上海麦克林生化科技有限公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒、过氧化氢酶（Catalase，CAT）测定试剂盒、总超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，T-SOD）测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；脂质氧化（Malondialdehyde，MDA）检测试剂盒、增强型ATP 检测试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、总蛋白提取试剂盒 上海碧云天有限公司；脱脂奶粉（纯度≥99%，货号：D8340） 北京索莱宝科技有限公司；沉默信息调节因子2 相关酶类1（silent mating type information regulation 2 homolog 1，Sirt1）抗体 北京博奥森生物技术有限公司；4%多聚甲醛液、Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体 武汉赛维尔生物科技有限公司；过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1α，PGC-1α）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinecontaining aspartate specific protease 3，Caspase-3）、B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、HRPGoat Anti-Rabbit IgG（H+L）、HRP-Goat Anti-Mouse IgG（H+L）抗体 Proteintech、3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phophoate dehy-drogenase，GAPDH）抗体 Cell Signaling Technology。

Centrifuge 5804 R 高速台式离心机 德国Eppendorf 公司；Tecan Spark®多功能酶标仪 瑞士TECAN 公司；PowerPac HC 美国伯乐高流电泳仪电源、Mini-PROTEAN Tetra 小型垂直电泳槽、Trans-Blot SD 转印槽 美国Bio-Rad 公司；Tanon-4600SF化学发光图像分析系统 上海天能科技有限公司；OLYMPUS IX73 倒置显微镜 日本OLYMPUS。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药 小鼠适应性喂养一周后，随机分为对照组（Con）、模型（DOX）组、D-核糖低剂量组（LDR）、D-核糖高剂量组（HDR），每组10 只。Con组、DOX 组灌胃给予生理盐水（10 mL/kg），D-核糖低剂量组灌胃给予D-核糖（0.9 g/kg，10 mL/kg），D-核糖高剂量组灌胃给予D-核糖（1.8 g/kg，10 mL/kg），均连续给药7 d。D-核糖的剂量选择参考袁保辉等[5]的方法。在第8 d 灌胃结束后30 min，除对照组腹腔注射生理盐水（5 mL/kg,下同）外，其余各组均腹腔注射DOX（15 mg/kg），期间小鼠全部存活。DOX 注射48 h 后处死小鼠，称体重后摘眼球取血，血液样本在室温下保存30 min,4000 r/min 离心15 min，获得用于生化分析的血清，并保存于−80 ℃冰箱备用。同时收集心脏组织并称重，计算心脏指数。部分心脏用于组织病理检测，部分置于−80 ℃保存，以便进行后续分析。

心脏指数（mg/g）=心脏重量（mg）/体重（g）

1.2.2 血清生化指标检测 小鼠在给予DOX 处理48 h 后，摘眼球取血，分离血清并保存于−80 ℃冰箱备用。按照LDH 测定试剂盒说明书测定血清中LDH 水平。

1.2.3 心脏组织苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin stain，HE）染色 参考文献[14]方法将心脏组织收集后置于4%多聚甲醛液中固定，48 h 后脱水、透明、浸石蜡，包埋，切片，进行HE 染色，脱水封片后显微镜观察心肌组织病理学变化。

1.2.4 心脏组织ATP 含量测定 称取心脏组织，用ATP 检测裂解液匀浆，制备10%组织匀浆。在4 ℃以12000 g 离心5 min，收集上清液，通过BCA 蛋白质测定试剂盒测定每个样品的蛋白质浓度。按照ATP 检测试剂盒说明书测定心脏组织ATP 含量。

1.2.5 心脏氧化应激水平分析 称取心脏组织，用预冷的生理盐水匀浆，制备10%组织匀浆。在4 ℃以2500 r/min 离心10 min，收集上清液，通过BCA 蛋白质测定试剂盒测定每个样品的蛋白质浓度。严格按照试剂盒说明书，测定心脏组织内T-SOD、CAT 活力和MDA 含量。

1.2.6 Western blot 检测相关蛋白表达水平 用总蛋白提取试剂盒提取心脏组织总蛋白，并用BCA 法测定样品蛋白浓度。随后，取等量蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE），使用聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）进行转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h。分别使用抗Sirt1、PGC-1α、Bax、Bcl-2、Caspase-3、GAPDH 抗体4 ℃孵育过夜；洗膜缓冲液（Tris Buffered Saline Tween，TBST）洗膜后加入相应的HRP-Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）、HRP-Goat Anti-Mouse IgG（H+L）二抗，室温孵育2 h，采用ECL 化学发光法进行显影。使用Image J 软件对蛋白表达水平进行定量分析，并将GAPDH 作为内参蛋白进行量化。

1.2.7 免疫组织化学法检测Caspase-3 表达水平组织切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，柠檬酸缓冲液抗原修复，3%的双氧水处理阻断内源性过氧化物酶，正常山羊血清封闭，加入兔源性Caspase-3 一抗4 ℃孵育过夜，次日加入山羊抗兔二抗室温孵育，二氨基联苯胺（3,3 N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride，DAB）显色，苏木素复染细胞核，脱水、透明、封片，显微镜下观察拍照。每只鼠选取3 张切片，应用Image J 软件进行定量分析，取切片中阳性染色的面积占总面积的百分比作为Caspase-3 相对表达量进行统计作图[15]。

1.3 数据处理

所有数据以均数±标准误（mean±SEM）表示，采用GraphPad Prism 5 软件进行统计分析并作图，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey’s 检验。其中，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 小鼠体重变化及心脏指数

由表1 可知，各组小鼠在进行DOX 和D-核糖处理前体重并无明显差异，而在进行DOX 处理48 h后，DOX 组小鼠的体重较Con 组小鼠显著降低（P＜0.05）。推测DOX 处理后小鼠体重显著下降可能主要与小鼠摄食量下降有关。虽然D-核糖处理组小鼠体重高于DOX 组，但并无显著差异（P＞0.05）。同时，各组小鼠处理后心脏指数无显著差异（P＞0.05），这可能与小鼠心脏质量变小，同时体质量下降有关。

表1 各组小鼠干预前后体质量变化及心脏指数比较Table 1 Comparison of body weight and heart index of each group before and after treatment

2.2 D-核糖对DOX 介导血清LDH 水平的影响

LDH 是常见心肌酶之一，在心肌受到损伤时，LDH 从受损的心肌细胞膜渗漏到血液中，是心脏毒性的标志酶之一[16]。如图1 所示，与Con 组比较，DOX 组小鼠血清中LDH 活性显著升高（P＜0.05），表明DOX 组小鼠心肌组织损伤严重，DOX 诱导心脏毒性造模成功；D-核糖各处理组LDH 活性降低，且随D-核糖剂量的增加而下降，HDR 组与DOX 组具有显著性差异（P＜0.05）。这与刘平怀等[10]研究发现的D-核糖可以降低缺血性心肌梗塞大鼠模型LDH 活性，改善心功能的结果一致。

图1 小鼠血清LDH 水平Fig.1 Contents of LDH in serum

2.3 D-核糖对DOX 介导心脏组织病理学的影响

组织病理学研究发现，DOX 可以导致心肌细胞发生空泡变性、心肌间隙增宽等病理改变[14,17]。如图2 所示，Con 组心肌细胞结构完整，心肌纤维排列整齐，横纹清晰，无明显组织病理学损伤。DOX 组心肌细胞内出现空泡变性，心肌细胞间隙明显增宽，表明模型建立成功。与DOX 组相比，LDR 组没有明显变化，HDR 组心肌细胞内可见空泡变性、心肌细胞间隙减少，心肌组织病理学损伤有明显改善。综上所述，D-核糖能使DOX 处理小鼠心脏组织形态趋于正常化，具有一定心脏保护作用。

图2 各组小鼠心脏组织切片病理学观察（HE，100 μm）Fig.2 Pathological observation of hematoxylin-eosin stain sections of heart biopsy (HE,100 μm)

2.4 D-核糖对DOX 介导心脏ATP 水平的影响

DOX 可导致心肌细胞线粒体肿胀和电子传递链的解偶联[18−19]，降低心肌细胞内ATP 水平（20%～50%），诱发心肌损伤[20−21]。Tang 等[22]研究表明，提高心肌组织内ATP 水平，可以显著改善DOX 介导的心脏损伤（P＜0.05）。如图3 所示，与Con 组比较，DOX 可显著降低心脏组织内ATP 含量（P＜0.05）；与DOX 组比较，LDR 组ATP 含量有一定升高，但无显著性差异（P＞0.05），而HDR 组ATP 含量显著升高（P＜0.05）。王亚坤等[23]研究发现D-核糖能够补充运动过程中消耗的ATP，对大鼠运动后心脏功能的恢复具有一定的作用。以上结果表明，D-核糖可能通过快速补充ATP，改善小鼠的心脏功能。

图3 各组小鼠心脏组织ATP 含量比较Fig.3 Comparison of ATP content in heart tissues of mice in each group

2.5 D-核糖对DOX 介导心脏氧化应激的影响

研究表明DOX 介导的心脏毒性与氧化应激密切相关[24]。氧化应激导致脂质过氧化物增加、DNA损伤和线粒体功能障碍，引发细胞死亡[25−26]。吴文英等[27]和Zhao 等[28]研究发现抑制氧化应激，可以减轻DOX 心脏毒性。如图4 所示，与Con 组比较，DOX可显著增加心脏组织内脂质过氧化产物MDA 的含量（P＜0.05），并降低心脏组织抗氧化酶T-SOD、CAT 活力（P＜0.05）；与DOX 组比较，LDR 组MDA含量有一定下降，T-SOD、CAT 活力有一定升高，但均无显著性差异（P＞0.05），而HDR 组MDA 含量显著下降，T-SOD、CAT 活力显著升高（P＜0.05）。上述结果表明，D-核糖可通过抑制DOX 介导的氧化应激损伤减轻其心脏毒性。

图4 各组小鼠心脏组织MDA、CAT、T-SOD 水平比较Fig.4 Comparison of MDA,CAT and T-SOD in heart tissue of mice in each group

2.6 D-核糖对DOX 介导心脏凋亡相关蛋白表达的影响

研究表明细胞凋亡是DOX 心脏毒性的重要机制之一，抑制细胞凋亡能够有效改善DOX 诱导的心脏毒性[29−30]。Bcl-2/Bax 比值降低启动细胞凋亡，并由Caspase-3 蛋白执行细胞凋亡。本研究中，如图5 Western blot 结果所示，与Con 组小鼠相比，DOX 可显著增加小鼠心肌组织内促凋亡蛋白Bax、Capsase-3的表达水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达水平（P＜0.05）；与DOX 组相比，LDR 组Bax、Capsase-3 表达水平有一定降低，Bcl-2 表达水平有一定升高，但无显著性差异（P＞0.05）；而HDR 组Bax、Capsase-3 表达水平显著降低，Bcl-2 表达水平显著升高（P＜0.05）。此外，Caspase-3 免疫组织化学结果如图5B、E 所示，与Con 组相比，DOX 组中Caspase-3 蛋白阳性表达增强（棕色）。与DOX 组比较，LDR 组Caspase-3 蛋白阳性表达无明显变化，而HDR 组Caspase-3 蛋白阳性表达明显降低。以上结果显示，D-核糖对DOX 心脏损伤的保护作用可能与其抑制细胞凋亡相关。

图5 各组小鼠心脏组织凋亡相关蛋白表达情况Fig.5 Expression of apoptosis-related proteins in heart tissues of different group of mice

2.7 D-核糖对Sirt1/PGC-1α 通路相关蛋白表达的影响

前期研究发现，激活Sirt1/PGC-1α通路，可以降低心脏氧化应激和线粒体损伤，缓解DOX 诱导的急性心脏毒性[31−33]。如图6 所示，与Con 组相比，DOX显著降低Sirt1、PGC-1α表达水平（P＜0.05）；与DOX组相比，LDR 组Sirt1、PGC-1α无显著变化（P＞0.05），而HDR 组Sirt1、PGC-1α表达水平显著升高（P＜0.05）。综上所述，推测D-核糖可能通过激活Sirt1/PGC-1α信号通路，提高ATP 水平，改善心肌组织能量代谢；同时抑制氧化应激和细胞凋亡，进而对DOX 介导心脏毒性发挥保护作用。

图6 各组小鼠心脏组织Sirt1/PGC-1α 通路表达情况Fig.6 Sirt1/PGC-1α pathway expression in heart tissues of different group of mice

3 讨论与结论

DOX 诱导心脏毒性的机制较为复杂，尚未完全阐明，可能与细胞凋亡、氧化应激、能量代谢障碍、自噬等相关[34−35]。心脏是机体主要的耗能器官之一，线粒体是心肌能量产生和储存的主要场所，心脏损伤时线粒体功能改变导致ATP 生成减少，ATP 水平是评价心肌损伤的标志之一[36]。本研究中，与Con 组相比，DOX 组小鼠心脏组织中ATP 水平显著降低（P＜0.05），提示心肌损伤；与DOX 组相比，HDR 干预小鼠心脏中ATP 水平显著升高（P＜0.05），LDR 组ATP 水平虽然表现出升高的趋势，但无显著性差异（P＞0.05），表明HDR 可能通过改善线粒体能量代谢改善DOX 介导的心肌损伤。

大量研究表明，DOX 进入细胞后代谢产生过量的ROS，诱导细胞氧化应激，下调抗凋亡蛋白Bcl-2/凋亡蛋白Bax，触发线粒体依赖的细胞凋亡，抑制细胞凋亡能够有效改善DOX 诱导的心脏毒性[29−30]。本研究中，与Con 相比，DOX 组小鼠心脏中T-SOD、CAT 活力显著降低（P＜0.05），MDA 含量显著增加（P＜0.05），提示氧化应激发生；同时，DOX 显著上调促凋亡蛋白Bax、Caspase-3 表达（P＜0.05），下调抗凋亡蛋白Bcl-2 表达，提示线粒体依赖的细胞凋亡发生。HDR 干预小鼠后，心脏中T-SOD、CAT 活力显著升高（P＜0.05），MDA 水平显著性降低（P＜0.05），这与之前的研究一致[3,37]。此外，与DOX 组相比，HDR干预显著下调促凋亡蛋白Bax、Caspase-3 表达（P＜0.05），上调抗凋亡蛋白Bcl-2 表达，但LDR 干预对上述指标无显著性影响（P＞0.05）。以上结果提示，D-核糖干预可能通过缓解DOX 介导的氧化应激抑制线粒体依赖的细胞凋亡，且具有一定的剂量效应。

沉默信息调节因子1（Sirt1）是一种烟酰胺腺苷二核苷酸（NAD+）依赖的转录调节因子参与调控氧化应激、细胞凋亡、线粒体功能等，在DOX 介导的心脏毒性中发挥重要的保护作用[38−39]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（PGC-1α）是线粒体生物合成、氧化代谢及细胞能量稳态的关键调控分子，在心脏代谢和功能发挥中起重要作用[22,29]。Liu 等[33]研究发现，紫檀茋通过激活Sirt1/PGC-1α通路，降低心脏氧化应激和线粒体损伤，缓解DOX诱导急性心脏毒性。与前述一致，本研究发现DOX显著下调Sirt1、PGC-1α的表达。与DOX 组相比，HDR 干预显著上调Sirt1、PGC-1α的蛋白表达水平（P＜0.05），但LDR 干预对Sirt1、PGC-1α表达无显著性影响（P＞0.05）。结果表明，HDR 可能通过激活Sirt1/PGC-1α通路调控线粒体功能（ATP 产生和抗氧化），且具有一定的剂量效应。

本研究初步探究了D-核糖对DOX 介导急性心脏毒性的保护作用。高剂量D-核糖干预可显著提高心肌组织中ATP 含量，缓解心肌氧化应激，抑制线粒体依赖的细胞凋亡，说明改善心肌细胞线粒体功能可能是D-核糖保护DOX 介导心肌损伤的重要机制之一。进一步的机制研究揭示，D-核糖对线粒体功能的改善作用与其激活Sirt1/PGC-1α信号通路有关。然而，D 核糖干预对DOX 心脏毒性最佳保护效果的剂量值得进一步研究。本实验结果为D-核糖在心血管疾病和肿瘤患者营养配方食品中的应用提供科学依据，有利于促进D-核糖在临床营养领域以及我国特殊医学用途配方食品行业的发展。