气相色谱—离子迁移谱技术分析干燥方式对柠檬片挥发性物质的影响

蒋 冰 丁胜华 张达莉 罗耀华 李 湘 付复华

(1. 湖南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410125；2. 湖南省农业科学院农产品加工研究所，湖南 长沙 410125)

柠檬(Citruslimon(L.) Burm. f.)为属芸香科柑橘属常绿小乔木，主要分布于东南亚、西欧、美国和中国等。据美国农业部统计[1]，2020年全球柠檬产量约840万t，其中鲜销量645万t，进出口量达434万t，加工量186万t。柠檬富含维生素C、维生素B、核黄素和矿物质等，具有预防癌症和心血管疾病等多种非传染性疾病的功效特性[2]。鲜柠檬水分含量较高，不易保藏。干制可以使果蔬保持低水分，防止微生物生长，降低相关酶活性，实现长期贮藏[3]。王海鸥等[4]研究了真空冻结冷冻干燥、冷冻干燥、热风干燥3种方式对柠檬片干燥特性及品质的影响，结果表明真空冻结冷冻干燥是高附加值柠檬片的首选干燥方法。杜腾飞等[5]比较了真空远红外干燥、热风干燥和真空冷冻干燥制备柠檬片的相关品质，研究表明真空远红外干燥和真空冷冻干燥对品质保留均有良好效果。高炜等[6]采用冷冻干燥、热风干燥、红外干燥及真空干燥对柠檬片进行干制，探究分析多酚含量及抗氧化能力，结果表明冷冻干燥处理组与热风干燥处理组柠檬游离态和总酚含量接近，柠檬中主要酚类物质是类黄酮。周琦等[7]研究表明微波功率1.01 kW、真空度72.4 kPa、柠檬片厚度4 mm条件下能较好地保持柠檬干的内外品质。王忠合等[8]采用超声波预处理柠檬片，研究超声辅助热风干燥的动力学，通过多指标证明超声预处理后热风干燥与空白组和热烫组相比，干燥速率增加，且能降低干燥过程维生素C的损失。

果蔬风味物质主要包括挥发性物质和非挥发性物质，前者决定果蔬特征香气，并为后者合成提供前体物质[9]。前人[10]17-18[11]通过GC-MS分析柠檬中挥发性物质组成，发现柠檬片中萜烯类化合物占据主导地位，主要烯烃为D-柠檬烯、萜品烯、β-蒎烯，主要醛类化合物为柠檬醛、壬醛、癸醛、己醛，主要醇类化合物为α-松油醇、橙花醇、4-萜烯醇、芳樟醇、香叶醇，主要酯类化合物为乙酸橙花酯。此外，柠檬果皮中的挥发性物质种类多于果肉中的挥发性物质，主要香气成分源自果皮[12]。气相—离子迁移谱(GC-IMS)技术与顶空固相微萃取结合气相色谱—质谱联用(HS-SPME-GC-MS)技术、电子鼻(E-nose)技术相比，具有检测浓度低、响应速度快等优点，已被广泛应用于多类果蔬的检测中[13-15]。然而，利用GC-IMS技术对不同干燥方式柠檬片中挥发性物质进行定性分析还鲜有报道。研究拟以尤力克柠檬为原料，采用气相—离子迁移谱(GC-IMS)结合主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，研究4种干燥方式对柠檬挥发性物质的影响，以期为柠檬干制方法的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料

柠檬：尤力克，原产地四川省安岳县，选择形状规则大小均一，无伤痕和无虫眼的柠檬作为试验原料。

1.2 主要仪器与设备

精密分析天平：BSA124S型，广州市授科仪器科技有限公司；

风味分析仪：FlavourSpec®型，配有Vocal软件和IMS、NTST数据库，德国G.A.S公司；

多功能切片机：mkd-p-1600a型，北京美科达科技公司；

冷冻干燥机：LGJ-25C型，北京四环福瑞科仪科技发展有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9053A型，上海精宏实验设备有限公司；

红外烘干箱：SAK-505型，江苏泰州圣泰科红外科技有限公司；

真空干燥箱：ZF-6050型，上海捷呈实验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理 选择质量形状相近的柠檬，清洗表面杂质。采用多功能切片机将柠檬切分成3 mm厚度的切片，选取大小均一、厚度均匀的柠檬片，收集备用。

1.3.2 柠檬片干燥 将4份质量相近的柠檬片分别通过4种干燥方式进行干燥，终点为柠檬片质量达到恒重。干制方法参照文献[10]10进行修改。

(1) 冷冻干燥(FD)：冷阱温度降至-50 ℃以下，物料温度降至-30 ℃以下，预冻24 h，升温速率保持为4 ℃/2 h，4层冻干面积均为0.25 m2，真空度低于30 Pa。

(2) 热风干燥(AD)：温度恒定60 ℃，风速恒定1 m/s，箱容积400 mm×400 mm×300 mm。

(3) 红外干燥(IRD)：温度恒定60 ℃，风速恒定1 m/s，加热管功率225 W，箱容积400 mm×400 mm×200 mm。

(4) 真空干燥(VD)：温度恒定60 ℃，箱容积415 mm×370 mm×345 mm，真空度保持为1 kPa。

收集干制柠檬片于避光密封袋中保存备用。

1.3.3 GC-IMS分析条件 将干燥样品粉碎，称取0.2 g样品(鲜柠檬切片，取2 g，含水率90%)，置于20 mL顶空瓶中，40 ℃平衡15 min后进样。检测条件根据文献[13]修改如下：色谱柱MXT-5(15 m×0.53 mm×1 μm)，色谱柱温度60 ℃，IMS温度45 ℃，进样针温度65 ℃，载气/漂移气均为N2，进样体积200 μL，分析时间20 min。漂移气流量150 mL/min；载气流量，0～2 min时为2 mL/min，2～20 min时由2 mL/min逐步提升至100 mL/min。试验重复3次。

1.4 数据处理

使用GC-IMS仪器配套VOCal软件查看数据的定性和分析谱图，使用软件内置的IMS数据库和NIST数据库进行物质的定性分析；使用Reporter插件进行二维和三维谱图的差异对比，Gallery Plot插件用于比较挥发性有机物含量在不同样品间的差异，Dynamic PCA 插件则用于主成分分析及其图表的绘制；利用Origin 2018软件中的Heat map with dendrogram插件绘制聚类分析热图；采用SIMCA 14.1进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，PLS-DA方法基于同时分解预测量矩阵X和类别矩阵Y提取因子，将因子依据相关性从大到小排列，最后通过交互验证确定隐变量个数，参与回归建模，是一种经典的多类别判别分析方法。

2 结果与分析

2.1 不同方式干燥柠檬片的挥发性物质定性分析

基于GC×IMS文库5种处理方式的柠檬片均被鉴定出72种挥发性物质(图1)，且检出成分相同，具体包括20种萜烯类物质、16种酯类物质、13种醛类物质、13种醇类物质、7种酮类物质、2种酸类物质和1种呋喃类物质(表1)。此外，5个处理组样品中还检出了12种未被定性的挥发性物质。由图1可知，在保留时间为100～600 s时共出现了61个信号峰，主要包括20种萜烯类物质、14种酯类物质、10种醛类物质、9种醇类物质、5种酮类物质、2种酸类物质和1种呋喃类物质；600～1 200 s时出现了9个信号峰，主要包括2种酯类物质、2种醛类物质、4种醇类物质和1种酮类物质。异松油烯、萜品烯、β-蒎烯、乙酸乙酯、壬醛、糠醇、3-羟基-2-丁酮等物质在迁移过程中还产生了二聚体或三聚体，其保留指数与保留时间非常接近，但迁移时间不同，新生成的二聚体质量大于单体，因此迁移时间增加[15]，生成的二聚体和三聚体信息可二次对挥发性物质定性，使定性结果更准确可靠。

表1 柠檬挥发性物质定性结果†

续表1

2.2 不同方式干燥柠檬片挥发性物质的气相离子迁移谱图分析

从图2可直观看出，不同样品中的挥发性物质存在差异，如黄圈中的挥发性物质(α-松油醇)在鲜柠檬中含量较高，而在4种干制柠檬片中的对应的挥发性含量均降低；由于糠醛、己醛、β-大马士酮等物质含量在图中差异较小，因此选取俯视图和差异图进一步进行差异对比。

由图3可知，4种干燥方式处理后的样品中挥发性物质含量之间存在差异，且与鲜柠檬存在明显差异，如IRD和AD处理中糠醛、己醛的信号峰红色相较于其他处理颜色更深，说明此物质在IRD和AD处理后的柠檬片中含量更高；IRD和VD处理中β-大马士酮的信号峰红色相较于其他处理颜色更深，说明此物质在IRD和VD处理后的柠檬片中含量更高。

2.3 不同方式干燥柠檬片挥发性物质的指纹图谱对比

由图4可知，20种萜烯类物质(A区域)在干燥过程中含量变化相对稳定，鲜柠檬和柠檬片均具有柑橘清香，何朝飞等[16]研究表明萜烯类物质是柑橘类水果主要的香气成分。柠檬烯、β-蒎烯、月桂烯和异松油烯等是柑橘的主要香气成分，在5种样品中均有检出，说明干制不会影响柠檬片的主要香气组分[17]，其主要香气成分由基因型决定，与品种相关[18]。试验选用原料均为尤力克柠檬，各处理后的柠檬片香气成分一致，离子迁移图(图1)也验证了这点。在干燥处理后，柠檬中的主要醇类物质和酯类物质，包括α-松油醇、芳樟醇、正己醇、3-甲基-1-戊醇、异戊醇、2-甲基-1-丁醇、1-戊烯-3-醇、乙醇和苯乙酸乙酯、丁酸丙酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、异丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯(B区域)，其含量较鲜柠檬均下降。与其他2种干燥方式相比，IRD和AD处理更好地保留了丁酸乙酯、乙酸甲酯、丙酸乙酯等物质，这可能是由于冷冻干燥和真空干燥处理均在低真空环境进行干燥，导致酯类物质逸出。丁酸乙酯和丙酸乙酯具有甜果香味，乙酸甲酯具有香料气味，说明IRD和AD处理可保留鲜柠檬中果香味挥发性物质。挥发性醇主要是由乙醇脱氢酶的作用产生，在高温条件下相关酶钝化或失活，从而造成醇类物质的损失[9]。α-松油醇是柠檬烯的降解产物，超过一定含量就会产生腐败味[19]，鲜柠檬中α-松油醇含量较高，4种干燥方式均显著降低了其含量，说明干制能抑制柠檬腐败味的产生，达到贮藏的目的。与鲜柠檬相比，FD处理后E-2-己烯醛、己醛、香叶醇等物质含量上升，香叶醇呈玫瑰和天竺葵香味，是柑橘水果重要的香气成分；AD处理后γ-丁内酯、糠醛、3-甲基-2-丁烯醛、3-羟基-2-丁酮、2-乙酰基呋喃、糠醇等物质含量上升(C区域)，2-乙酰基呋喃和糠醇呈现甜的焦糖风味[19]，热风干燥后的柠檬片呈现烤制风味；IRD处理后苯乙酮、E-2-戊烯醛、庚醛、戊酸等物质含量上升，苯乙酮、糠醛、己醛呈烤制香味，说明IRD柠檬片与鲜柠檬相比，烤制香味更为浓郁，可能与红外加热有关；VD处理后柠檬醛、β-大马士酮、癸醛、壬醛、异胡薄荷醇、乙酸异戊酯、癸酸乙酯等物质含量上升，柠檬醛是柠檬香气的主要成分，说明VD可保留部分鲜柠檬香气成分。己醛、癸醛是鉴定橙皮油的一个标准，在5种样品中均检出[16]。除FD处理外，其余3种干燥后的柠檬片均为橙色，这是因为在加热过程中，水分大量损失，柠檬表皮皱缩，美拉德反应使柠檬颜色由黄变橙[20]。鲜柠檬挥发性物质以萜烯类、酯类和醇类为主，干制后的柠檬片挥发性物质以萜烯类、醛类为主。

图1 不同方式干燥柠檬片的挥发性物质离子迁移谱

图2 不同方式干燥柠檬片的GC-IMS三维谱图

红色代表该物质在此样品中含量比对照组高，如图中红色方框区域；蓝色代表该物质在此样品中含量比对照组低，如图中蓝色方框区域；颜色越深，说明含量差异越大

A为不同方式干燥柠檬片挥发性萜烯类物质；B为干燥处理后柠檬片含量下降的挥发性物质；C为AD处理后柠檬片含量上升的挥发性物质；每一列代表同一挥发性物质在不同样品中的信号峰，红色越深，含量越高，数字编号的是未鉴别的峰

2.4 不同方式干燥柠檬片挥发性物质的主成分分析

如图5所示，PC1和PC2分别为53.6%和19.4%，总和为73%，能够解释样品的总体变异[21]。鲜柠檬单独位于第一象限，不同方式干燥柠檬片均位于第二、三象限，AD和IRD处理与鲜柠檬距离较近，可能是因为热风处理相较其他方式对鲜柠檬中的丁酸乙酯、乙酸甲酯、丙酸等物质保留率较高；AD处理与IRD处理、VD处理较为相似，而与FD处理差异较大，这是由于前3种方式均采用了60 ℃ 热加工处理，经热干燥处理的样品风味较为接近。通过计算每两个样本之间的欧几里得距离，得到不同干燥方式处理的柠檬样品的最近邻—欧氏距离图(见图6)。结果表明，5种样品之间可明显区分，IRD处理和AD处理距离最近，相似度最高，因为两种干燥方式处理后的柠檬片中己醛、糠醛及部分未鉴别物质含量均有增加，与指纹谱图和PCA结果一致。

图5 不同方式干燥柠檬片挥发性物质的主成分分析

图6 不同方式干燥柠檬片指纹图谱的相似度分析

2.5 不同方式干燥柠檬片挥发性物质的PLS-DA分析

经PLS-DA分析，模型的R2X=0.952、R2Y=0.973、Q2=0.912，R2X越接近1表明模型越稳定，Q2>0.5表明预测率较高。图7是PLS-DA置换结果(置换验证次数200次)，右侧是PLS-DA原始值，左侧为PLS-DA模拟值，左侧的R2和Q2均比右侧低，且R2和Q2的回归斜率大于1，Q2的回归线截距为负值，说明该模型稳定性良好，具有较好的预测能力[22-23]。

图7 不同方式干燥柠檬片挥发性物质的PLS-DA拟合曲线

通过GC-IMS指纹图谱，将不同干燥方式柠檬样品中的72种挥发性物质基于PLS-DA模型中的变量投影重要性(VIP)将每个变量的贡献进行量化，筛选VIP值>1的挥发性物质作为潜在的特征性物质。如图8所示，柠檬干燥过程中共有23种可鉴定特征挥发性物质(VIP>1)，包括乙醇、丁酸乙酯(D)、乳酸乙酯、α-松油醇、糠醛(D)、β-大马士酮、芳樟醇、苯乙酮、乙酸乙酯(D)、萜品烯(D)、E-2-乙烯醛(M)、E-2-乙烯醛(D)、柠檬醛、己醛、α-萜品烯(D)、莰烯、α-蒎烯(D)、α-水芹烯(D)、苯乙酸乙酯、壬醛(M)、萜品烯(M)、β-蒎烯(D)、双戊烯(M)。

图8 不同方式干燥柠檬片挥发性物质的VIP值分布

通过模型筛选，依据VIP值>1的23种挥发性物质的峰值强度绘制聚类热图，如图9所示，每个处理组3个平行都聚为一类，平行性良好，处理间可较好区分；IRD处理和VD处理聚为第Ⅰ类，AD处理和IRD、VD处理聚为第Ⅱ类，FD处理和其他3种处理聚为第Ⅲ类，鲜柠檬与4种柠檬片聚为第Ⅳ类，说明鲜柠檬与4种柠檬片差异最大。利用GC-IMS从柠檬中共检出20种萜烯类物质(表1)，经PLS-DA，8种萜烯类物质是标志性挥发化合物，包括萜品烯(D)、α-萜品烯(D)、莰烯、α-蒎烯(D)、α-水芹烯(D)、萜品烯(M)、β-蒎烯(D)、双戊烯(D)，经过4种干燥处理，柠檬片中萜烯类物质均有增加(表2)，萜烯类物质是植物精油的主要成分，具有抑菌效果[15]，说明干制可达到贮藏柠檬的目的；利用GC-IMS从柠檬中共检出16种酯类物质(表1)，经PLS-DA，4种酯类物质是标志性挥发化合物，包括丁酸乙酯(D)、乳酸乙酯、乙酸乙酯(D)、苯乙酸乙酯，经过4种干燥处理，柠檬片中酯类物质均有减少(表2)，但IRD和AD处理对于酯类物质保留效果较好，与指纹谱图(图4)结果一致；利用GC-IMS从柠檬中共检出13种醛类物质(表1)，经PLS-DA，6种醛类物质是标志性挥发化合物，包括糠醛(D)、E-2-乙烯醛(M)、E-2-乙烯醛(D)、柠檬醛、己醛、壬醛(D)，醛类物质对柠檬香气有贡献作用，总醛含量决定柠檬香气质量[24]，柠檬醛为呈味物质，糠醛、己醛、壬醛等醛类物质对柠檬片香气具有贡献作用，经过4种干燥处理，柠檬片中醛类物质均有增加(表2)，4种柠檬片的香气品质均得到提升，其中糠醛和己醛呈烤制香味，在IRD和AD处理中含量增加较多，说明这两种方式干制的柠檬片具有更明显的烤制香味；利用GC-IMS从柠檬中共检出13种醇类物质(表1)，经PLS-DA，3种醇类物质是标志性挥发化合物，包括乙醇、α-松油醇、芳樟醇，经过4种干燥处理，柠檬片中醇类物质均有减少(表2)，但IRD处理可保留更多的醇类物质，可能是由于真空环境会造成醇类物质损失，且热风干燥强度较大时也会造成醇类物质损失；利用GC-IMS从柠檬中共检出7种酮类物质(表1)，经PLS-DA，2种酮类物质是标志性挥发化合物，包括β-大马士酮、苯乙酮，经过IRD和VD处理后两种酮类物质均增加(表2)，β-大马士酮和苯乙酮均呈现花香味，说明IRD和VD处理赋予了柠檬片更浓郁的花香味。与前面结果有所不同的是，热图显示IRD与VD处理较为相近，但前两种处理效果仍与AD处理接近，说明3种处理方式存在共通之处，可能是由于使用了同一干燥温度。

图9 不同方式干燥柠檬片挥发性物质的聚类热图

表2 柠檬中标志挥发性成分峰值强度†

3 结论

采用气相色谱—离子迁移谱技术对比分析了鲜柠檬及4种干燥方式处理的柠檬片样品中挥发性物质的差异。5种样品共检出并定性了72种挥发性物质，包括20种萜烯类物质、16种酯类物质、13种醛类物质、13种醇类物质、7种酮类物质、2种酸类物质和1种呋喃类物质，其中多对成分为其单体及二聚体和三聚体，由此构建风味物质迁移指纹图谱。结果表明，标志挥发性萜烯类物质在干燥过程中较为稳定，但酯类和醇类物质含量相对下降，干燥后4种样品中的醛类物质有不同程度的上升；红外干燥与热风干燥和真空干燥效果的相似度较高，但红外干燥相对于其他处理方式效果较好，对标志挥发性酯类物质保留率高于其他处理组11%～27%，同时标志挥发性醛类物质含量增加较多，与鲜柠檬相比增加了53%，对其风味具有积极影响。