基于网络药理学及分子对接探讨冠心2号方治疗冠心病的作用机制

刘振飞，刘 爽，张世亮

冠心病(coronary heart disease，CHD)是一种常见的慢性心血管系统疾病，好发于老年人，近年来患病率呈逐年上升趋势[1]。我国CHD患病人数每年以20%的平均速度递增，CHD病死率占所有典型心血管疾病死亡病例总数的10 %～20 %[4]。CHD在中医上归于“胸痹”范畴，其病位主要在心，病理因素可有寒凝、痰浊、血瘀等[2]，其中又以血瘀最为多见[3]。在治疗CHD方面，中药具有多通路、多靶点等优势，在临床中疗效显著[5]。冠心2号方由丹参、红花、赤芍、川芎、降香5味药组成，具有活血化瘀之功，中华中医学会心血管病分会发布的《冠心病稳定型心绞痛中医诊疗指南》[6]提出治疗心血瘀阻型冠心病心绞痛首选冠心2号方。

网络药理学是在药物分子水平上构建“药物-成分-疾病”的靶点网络图。其整体性与系统性与中医药研究的整体观与辨证论治相契合[7-8]。近年来，国内外学者利用网络药理学对治疗心力衰竭、CHD、糖尿病等多种疾病的中药复方、单味药及药对作用进行了研究[9-11]。本研究通过网络数据库分析研究冠心2号方在治疗CHD的作用机制，为冠心2号方在临床的应用研究提供新的理论思路与方法。

1 资料与方法

1.1 冠心2号方活性成分的获取与筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcm-spsearch.php)中分别录入丹参、红花、赤芍、川芎、降香进行检索，根据口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18条件选出有效成分，并且获取成分对应的靶点。然后将导出的靶点直接导入UniProt数据库(https：//www.unitprot.org/)进行基因的标准化处理。

1.2 CHD疾病靶点的获取与预测 在GeneCards(https：//www.genecards.org/)数据库中以“coronary heart disease”进行检索，将检索到的蛋白名称复制到UniProt数据库中进行基因的标准化处理，得到CHD的靶点信息，共有949个。

1.3 冠心2号方活性成分与疾病网络的构建与分析 将冠心2号方的成分靶点与CHD的靶点取交集，寻找两者的共同靶点，并导入Cytoscape 3.7.2软件，组建“药物-成分-靶点-疾病”网络。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络图的构建与分析 将冠心2号方与CHD的共同靶点输入STRING数据库，限定物种为智人，构建“冠心2号方-CHD靶点”的PPI网络图。利用Cytoscape 3.7.2软件中的Network Analyzer进行分析，根据节点度(Degree)≥38进行筛选，得到冠心2号方治疗CHD的核心靶点。

1.5 生物通路及富集分析 利用DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)数据库对冠心2号方治疗CHD的共同作用靶点进行分析。将上述共有靶点导入DAVID，物种设置为智人，进行分析，通过通路富集结果对冠心2号方治疗CHD的作用机制进行预测。

1.6 分子对接 通过TCMSP数据库下载冠心2号方活性成分化合物的3D结构。通过PDB数据库(http：//www1.rcsb.org/)下载目的靶点蛋白3D结构，利用AutoDock 1.5.6对蛋白质进行除氢、去水、去除小分子配体等操作，将化合物和蛋白进行蛋白-分子对接，其结果以结合自由能的高低作为与化合物结合程度的评价标准，使用Pymol 2.5软件实现对接结果可视化。

2 结 果

2.1 冠心2号方活性成分的靶点筛选及预测 通过TCMSP筛选获得冠心2号方有效成分160个，其中丹参最多，65个；降香次之， 37个；红花22个；赤芍29个；川芎最少，7个。具体活性成分见表1。

表1 冠心2号方有效成分

(续表)

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2.2 冠心2号方成分靶点的预测及成分-靶点网络图的构建 将冠心2号方的有效成分作用靶点与CHD的靶点取交集，通过网络合并，获得冠心2号方和CHD的共有靶点74个(见图1)。利用Cytoscape3.7.2软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图，见图2。网络图中共有节点204个，红色“V”形代表疾病CHD，绿色六边形代表中药丹参、红花、赤芍、川芎、降香，浅蓝色菱形代表冠心2号方中有效成分共124节点，深蓝色圆形代表冠心2号方与CHD共有的靶点共74节点，其中最大自由度111，最小自由度为2，平均自由度为13.37。槲皮素、山奈酚、木犀草素、黄芩素、β-谷甾醇度值最高，说明其在治疗冠心病中发挥主要作用。

图1 冠心2号方治疗CHD的药物-疾病共同靶点韦恩图

图2 冠心2号方治疗CHD的药物-成分-靶点-疾病网络图(DS为丹参，JX为降香，CS为赤芍，HH为红花，CX为川芎)

2.3 核心靶点的筛选 将冠心2号方与CHD的74个共同靶点导入STRING数据库建立“冠心2号方-CHD”靶点的PPI网络，见图3，共得到74个节点、833条边，平均节点度为22.5；再将该结果以TSV格式导出，通过Cytoscape 3.7.2软件对该网络进行拓扑分析，以蓝色圆形代表共同靶点，Degree值越大，圆形越大。以Degree值≥38为筛选标准，得到17个核心靶点，见表2，并一起构成核心网络图，节点蓝色越深、面积越大，代表Degree值越大，该靶点自由度越高。边颜色越深，宽度越大，证明两个节点之间联系越紧密，见图4。

表2 冠心2号方治疗CHD的核心靶点

图3 冠心2号方治疗CHD的“成分-疾病”靶点PPI网络图

图4 冠心2号方治疗CHD的核心靶点网络图

2.4 生物通路及富集分析 将冠心2号方治疗CHD的PPI网络筛选出的17个核心靶点导入DAVID数据库进行富集分析，共获得93条基因本体(GO)条目(P<0.05)，其中生物途径(biological process，BP)62条，细胞定位(cell component，CC)11条，分子功能(molecular function，MF)20条。包括一氧化氮(NO)生物合成过程的正调控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、平滑肌细胞增殖的正调控(positive regulation of smooth muscle cell proliferation)等。将GO条目中的信息利用Omicshare平台构建高级气泡图，见图5。京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集信号通路74条(P<0.05)，包括NOD样受体信号通路、TNF信号通路、雌激素信号通路等。选取前20名信息通路，详见表3。

图5 冠心2号方治疗CHD的GO功能富集分析图

表3 冠心2号方治疗CHD的KEGG功能富集信号通路

(续表)

2.5 分子对接分析 将冠心2号方作用靶点较多的前两位成分槲皮素、山奈酚与核心靶点蛋白Degree值前两位IL-6及VEGFA分别进行分子对接结合，结果如表4所示，一般而言，结合能<-20.9 kJ/mol说明可形成稳定的对接结构，使用Pymol 2.5软件实现对接结果可视化，观察结合位点名称及两结合位点之间的距离。详见图6、图7。

表4 冠心2号方治疗CHD的主要活性成分与靶点的结合能 单位：kJ/mol

图6 槲皮素与IL-6、槲皮素与VEGFA的分子对接3D模式图

图7 山奈酚与IL-6、山奈酚与VEGFA的分子对接3D模式图

3 讨 论

本研究利用网络药理学技术，通过网络数据库找到冠心2号方的活性化学成分160个，与CHD交集靶点74个，GO富集分析条目93条，KEGG富集分析得到信号通路74条。温昭君[12]在进行了85例临床观察后发现，冠心2号方治疗CHD疗效较好，且相对于对照组，实验组不良反应较少。李黔云等[13]进行108例CHD稳定型心绞痛的临床观察，发现冠心2号方能明显改善冠心病病人的症状、体征、心电图，提高生活质量。从冠心2号方的活性成分分析，度值最高的前5位分别为红花中的槲皮素、山奈酚，丹参和红花中共有的木犀草素，赤芍和红花中共有的黄芩素，赤芍、红花及降香中共有的β-谷甾醇。槲皮素、木犀草素、黄芩素、山奈酚都属于黄酮类化合物。槲皮素具有抗氧化、抗炎症、保护心血管等作用，其通过减少氧化应激、干扰肾素-血管紧张素-醛固酮系统和下调活性氧介导的下游信号通路等方式发挥作用[14]。槲皮素进行抗动脉粥样硬化的机制可能是通过下调高迁移率族蛋白1(HMGB1)、Toll样受体4(TLR4)的蛋白和基因表达，并且呈剂量依赖性和时间依赖性[15]。山奈酚可通过抑制氧化应激和炎症反应来防止动脉粥样硬化的发生[16]。木犀草素可以预防心血管疾病的发生，机制为改善较高的血压状态和胆固醇含量[17]。黄芩素化学名称为5，6，7-三羟基黄酮，与木犀草素相同都由降压作用，同时又具有扩张血管、心肌保护、保护内皮细胞以及抗动脉粥样硬化等药理活性，从而达到血管保护的作用[18]。β-谷甾醇属于植物甾醇，具有抗氧化、抗炎、免疫调节、抗肿瘤等作用[19]，研究发现β-谷甾醇能明显降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白的水平[20]，降低动脉硬化指数[21]，从而发挥抗动脉硬化作用。通过对冠心2号方有效成分的分析发现，冠心2号方通过降压、降脂、抗炎、抗氧化等多种途径来治疗CHD，具有多途径的特点。在PPI网络图中，得到与CHD交集自由度较高的靶点有IL6、VEGFA、TNF、TP53、MAPK1。IL6是其基因转录的一种多功能细胞因子，包含184个氨基酸，其在机体病理和生理活动中发挥多种作用，例如急性炎症反应、自身免疫性疾病和肿瘤形成[22]。VEGFA广泛存在于人的心、脑、骨骼等器官中，能够促进新生血管的形成及血管内皮细胞的生长，并能够改善心肌重塑，保护存活心肌细胞[23]。TNF是可以损伤肿瘤细胞且使其坏死的物质，TNF最重要的是对肿瘤的作用，同时也对心血管疾病有着重要的治疗意义，并且VEGF须依靠TNF-α才能调节血管内皮高度渗透性的状态[24]。TP53属于肿瘤抑制因子，能够抑制肿瘤的产生与生长，其机制为抑制细胞生长与诱导细胞凋亡、促进DNA损伤修复。同时在细胞自噬及葡萄糖代谢中也发挥重要作用[25]。MAPK1又称为细胞外信号调节激酶2，在细胞的炎症性反应、生长、分化、增殖和生存等生理过程中有重要调控作用[26]。

GO富集结果显示，在BP过程富集条目主要为NO生物合成过程的正调控、平滑肌细胞增殖的正调控、对脂多糖(LPS)的细胞反应。NO由血管内皮细胞分泌，有维护血管正常收缩的功能，当NO分泌不足或过多时，会出现血管舒缩异常的症状，从而引起冠心病的发生与促进冠心病的发展[27]。VSMCs增殖是动脉粥样硬化的重要病理改变，PDGF、成纤维细胞生长因子、血栓素A2、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、极低密度脂蛋白都可使VSMCs增殖，在冠心病的发生发展中发挥重要作用[28]。脂多糖是冠心病机制性生物学标志物，能够引导形成泡沫细胞并促进胆固醇酯在低密度脂蛋白中的累积，从而导致动脉粥样硬化的发生与发展，脂多糖浓度越高，动脉内膜厚度越厚[29-30]。由此推测，冠心2号方可能通过增加NO分泌，减少平滑肌增殖，减少脂多糖等途径来治疗冠心病。

从KEGG富集分析结果可知，在治疗过程中涉及的通路主要有NOD样受体信号通路、TNF信号通路、雌激素信号通路等。张晓林[31]在研究中发现，大鼠肾脏缺血再灌注损伤中可激活NOD2信号通路介导的炎症途径导致急性肾损伤，予NADPH氧化酶抑制剂抑制氧化应激后可阻断NOD2样受体依赖的炎症途径以减轻肾脏缺血再灌注损伤。TNF介导的信号通路具有促进细胞生长、分化、凋亡和诱导炎症的作用[32]。雌激素具有保护血管内皮细胞的作用，其过程与抑制PERK信号通路引起的内质网应激凋亡的过程有关[33]。由此推测冠心2号方可能通过减轻炎症反应，以及减少细胞凋亡来保护血管内皮，从而达到治疗冠心病的目的，说明冠心2号方治疗CHD的路径较多，机制相对较为复杂，同时也提示该生物过程将会是未来研究冠心2号方治疗CHD的方向。

采用分子对接技术将槲皮素、山奈酚与核心靶点蛋白IL6及VEGFA分别进行分子对接结合，进行结合能力预测，结果发现槲皮素、山奈酚与IL6及VEGFA成分与有较强的结合能力，且结合较为稳定。冠心2号方在治疗CHD方面具有多通路、多靶点、多成分的特点，本研究通过网络药理学技术发掘预测并优选冠心2号方有效成分及其作用靶点，构建可视化“成分-靶点-疾病-通路”多层次、多维度网络图，明确其药效物质基础，深入探究其治病机制，阐明其靶点作用通路，为冠心2号方后续的处方优化及药效学评价提供参考。同时也为其他复方中药的研究提供思路与方法，促进现代中医药发展及新药的发现与创新。