黑果枸杞GRF转录因子家族鉴定与生物信息学分析

杜 雨， 刘 筠， 胡晓桐， 贾西贝， 柳 迪， 马彦军

(甘肃农业大学林学院， 甘肃 兰州 730070)

生物调节因子(general regulatory factor，GRF)是调节植物生长、发育的特异转录因子[1]。第一个从植物中鉴定出来的GRF为水稻(Oryzasativa)OsGRF1，结果表明这些成员在水稻叶和茎的发育过程中起重要的调控作用[2]；随后的研究进一步表明了这些转录因子在植物生长和适应方面的关键性作用，包括根系发育[3]，开花[4-5]，叶片大小和寿命[6]，如拟南芥的AtGRF1和AtGRF2控制叶片和子叶的大小，AtGRF1/AtGRF2/AtGRF3突变体通过细胞增殖和细胞膨胀的调控产生较小的叶片和子叶[7]。AtGRF4对子叶和茎顶端分生组织发育有重要影响，同时也参与叶细胞的增殖[8]。AtGRF5与AtGIF1协同作用，正向调控叶原基的发育[9]。GRF蛋白的N端有QLQ(Gln、Leu、Gln)和WRC(Trp、Arg、Cys)保守结构域[2]，且QLQ存在于所有的真核生物中[2]，WRC则是植物特有的保守结构域[2,10-11]。除此之外，在一些GRF的C端发现了其他保守区域，如FFD(Phe、Phe、Asp)、TQL(Thr、Gln、Leu)和GGPL(Gly、Gly、Pro、Leu)[2,7,12]；然而，它们的角色尚未揭晓[13]。

此外，有研究报告指出GRF能积极响应非生物胁迫[14-17]。如：拟南芥(Arabidopsisthaliana)中调节植物渗透胁迫耐受性的DREB2A基因，其激活需要抑制至少一个GRF[18-19]。在正常条件下，AtGRF7与DREB2A启动子结合，抑制该基因表达；在非生物胁迫下导致AtGRF7表达受到抑制，从而激活DREB2A基因，同时AtGRF7还参与对NaCl胁迫抗性的负调控过程[15]。在辣椒(Capsicum)中CaGRF2，CaGRF3，CaGRF6，CaGRF7，CaGRF8调控辣椒盐胁迫过程[20]。大白菜中(Brassicarapa)BrGRF5基因不仅参与对生长发育的正调控，还参与对盐和渗透胁迫的负调控[21]。在冷和盐等胁迫下木薯(Manihotesculenta)的MeGRF4基因呈上调表达[22]。在热、盐和干旱胁迫下玉米(Zeamays)的ZmGRF4和ZmGRF13有较高的表达[23]。在白刺中GRF3，GRF3like-3，GRF2like参与盐胁迫应答，且具有各自不同的调节功能[24]。此外，在烟草(Nicotianatabacum)[25]和菊花(Chrysanthemummorifolium)[26]也发现了部分成员积极参与非生物胁迫。

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr．)为茄科(Solanceae)枸杞属(LyciumL.)多年生灌木，多棘刺和分枝，无主枝。主要分布于我国西北荒漠地区[27]。黑果枸杞具有耐干旱、抗盐碱的生物学特性，是改良荒漠化土壤的优良植物[28]，同时也是荒漠区特有的先锋植物，具有较高的经济和营养价值[29-30]。目前已从拟南芥[7](9个)、水稻[31](12个)、白菜[32](BrassicacampestrisL.)(17个)、玉米[12](14个)、烟草[33](25个)和番茄[17](Solanumlycopersicum)(13个)等多种植物中鉴定了GRF转录因子家族，但对黑果枸杞中的GRF基因仍缺乏系统的报道。因此本研究基于黑果枸杞在不同浓度NaCl胁迫下转录组数据，通过生物信息学的方法系统鉴定了黑果枸杞GRF基因家族成员，并进行序列比对，MEME分析，构建进化树及表达谱分析，为深入研究GRF基因在黑果枸杞抗盐性方面所发挥的作用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取甘肃农业大学林学组培实验室保存的黑果枸杞组培苗为实验材料。培养条件为：白天温度(22±2)℃，夜晚温度(20±2)℃，光照时间16 h·d-1，相对湿度约65%，光照强度约700 μmol·m-2·s-1。1/2MS培养基配方为：1/2MS培养基2.47 g·L-1，蔗糖20 g·L-1，琼脂5 g·L-1，NAA 0.2 mg·L-1，IBA 0.2 mg·L-1。2周后，选择生长健康、长势一致的黑果枸杞组培苗，开盖炼苗5 d后，将样品移栽到1/2Hoagland营养液中培养。1/2 Hoagland营养液配方(pH=5.7)为：2 mmol·L-1KNO3，0.5 mmol·L-1KH2PO4，0.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O，0.5 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O,50 μmol·L-1H3BO3，10 μmol·L-1MnCl2·4H2O,1.6 μmol·L-1ZnSO4·7H2O,0.6 μmol·L-1CuSO4,0.05 μmol·L-1Na2MoO4·2H2O,0.06 μmol·L-1Fe-citrate·2H2O[34]。2周后，在1/2 Hoagland营养液中加入50 mM和250 mM NaCl进行盐胁迫处理，然后分别在处理后0，1和12 h取样，并将未经任何盐处理的样品作为对照组。每处理每时间3个生物学重复，分别取根、茎和叶各0.1 g，立即在液氮中冷冻，并在-80℃下储存，直到用于总RNA分离。

1.2 方法

1.2.1盐胁迫下黑果枸杞GRF基因家族的筛选及理化性质分析 在转录组测序的NR、KOG和Swiss-Prot 3个数据库进行注释，筛选出的候选基因的蛋白序列导入NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)逐个进行蛋白序列预测，利用Pfam和NCBI的CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)进行保守结构域分析后进入Intreproscan再次进行验证，剔除不含有GRF蛋白保守结构域的序列，最终得到黑果枸杞GRF蛋白序列。在线软件ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)用于GRF转录因子家族的氨基酸大小、分子量、脂肪系数、不稳定数和等电点等的预测。用统一的前缀“Lr”对黑果枸杞中的GRF成员进行排序。

1.2.2盐胁迫下黑果枸杞GRF基因家族保守域验证与基序分析 利用开放阅读框(ORF)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)预测LrGRFs基因的氨基酸序列。利用DNAMAN8.0软件对LrGRFs基因的氨基酸序列进行多序列比对并绘制多序列比对图。通过在线工具MEME(https://meme.nbcr.net./meme/tools/meme)对黑果枸杞GRF基因保守结构域元件(Motif)进行分析，根据Bailey[35]描述的方法，最佳图案宽度为5～50，最大图案数为5。通过TBtools(https://github.com/CJ-Chen/TBtools)软件对导出的MEME文本结果进行保守基序图的绘制。

1.2.3盐胁迫下黑果枸杞GRF系统发育和表达谱分析 运用MEGA-X软件(10.0.2版)对拟南芥、水稻、黑果枸杞、番茄和玉米进行了系统发育树的构建。从TAIR(http://www.arabidopsis.org/)和UniPort(https://www.uniprot.org)中下载拟南芥、水稻、玉米和番茄的序列。利用最大似然算法ML，Piosson model，bootstrap1000，进行进化分析。进化树结果则用在线软件iTOL(http://itol.embl.de/)进行美化。利用TBtools软件的Heatmapper程序，构建LrGRF基因的根部与叶部组织的表达谱。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫下黑果枸杞GRF基因筛选

利用转录组数据筛选并剔除冗杂序列得到25条GRF转录组序列，进一步利用Pfam和NCBI的CDD筛选出具有QLQ或WRC结构域的蛋白序列，最终检索到14个LrGRFs转录因子家族成员，并将其命名为LrGRF1～LrGRF14(表1)。利用在线工具ExPASy对得到的14个LrGRFs氨基酸序列进行预测分析(表1)，结果显示不同GRF转录因子的蛋白序列存在较大差异,预测的氨基酸数目在136(LrGRF14)～585 aa(LrGRF2)之间；分子量在14.566 97(LrGRF14)～62.986 65 kDa(LrGRF2)之间；理论等电点介于5.58(LrGRF14)～9.33(LrGRF3)之间，其中有3个酸性蛋白和11个碱性蛋白。蛋白质稳定性均高于40。脂肪系数结果显示14个LrGRFs均为亲水性蛋白。

表1 黑果枸杞GRF转录因子的理化性质Table 1 The physicochemical properties of GRF transcription factors in L.ruthenicum

表2 模式植物基因ID号Table 2 Gene ID of model plant

2.2 黑果枸杞GRF基因家族保守域验证与基序分析

为了了解LrGRF结构域的结构特征，对14个LrGRFs蛋白序列做多序列比对。由图1可知，具有QLQ和WRC保守结构域的LrGRFs蛋白序列有10个，其中LrGRF7，LrGRF10和LrGRF11基因仅包含1个WRC，LrGRF14基因仅含有QLQ。QLQ结构域由19～159个氨基酸组成，WRC结构域由38～234个氨基酸组成，在两个结构域中均有多个保守不变的氨基酸位点，分别为QX3LX2Q和CX9CX10CX2H(图1)。

图1 黑果枸杞GRF转录因子的多序列对比Fig.1 Multiple sequence alignment of GRF transcription factors in L.ruthenicum

为了更好地了解不同LrGRF中Motif的相似性和多样性，通过MEME软件对黑果枸杞GRF家族成员进行保守序列分析。结果如图2，黑果枸杞GRF家族含有5个保守基序，依次命名为Motif1～Motif5；通过CDD数据库验证，Motif 1对应WRC结构域，Motif 2对应QLQ结构域，Motif4对应FFD结构域；基序的长度从18个aa(motif 4)到49个aa(motif 3)；LrGRF中含Motif 1基序的有13个，含Motif 2基序的有10个，只含Motif 3基序的有4个，含Motif 4基序的有10个，含Motif 5基序的有4个。除了LrGRF14仅含有1个Motif 2基序外，其余的成员均含有2个以上的基序。由图2可知，Motif 1和Motif 2的氨基酸序列比其他基序的保守性高，与结构域的保守性一致。

图2 黑果枸杞GRF转录因子的蛋白保守基序Fig.2 The protein conserved motif of LrGRF transcription factor in L.ruthenicum注：使用MEME程序鉴定的LrGRF家族蛋白中的保守基序Note：LrGRF family proteins identified using the MEME program

2.2 LrGRF的系统进化树分析

为了更好地了解黑果枸杞GRF基因家族的系统发育关系，选择黑果枸杞的14个LrGRFs基因，拟南芥的9个GRFs蛋白，水稻的12个GRFs蛋白，玉米的14个GRFs蛋白和番茄的13个GRFs蛋白序列构建系统发育树(图3)。结果表明(图3)，14个LrGRFs被分成 7个亚族(Ⅰ～Ⅶ)，Ⅰ亚族含有LrGRF1和LrGRF5，Ⅱ亚族含有LrGRF9，Ⅲ亚族没有含有LrGRF基因，Ⅳ亚族含有LrGRF4，LrGRF7，LrGRF11和LrGRF13，Ⅴ亚族含有LrGRF3和LrGRF12，Ⅵ亚族含有LrGRF8，LrGRF10和LrGRF14，Ⅶ亚族含有LrGRF2和LrGRF6。同时还表明IV亚族和Ⅶ亚族的GRF蛋白数量较多，分别有15和13名成员，没有水稻和玉米GRF蛋白则被归入Ⅰ，Ⅴ和Ⅵ亚族。此外，在系统发育树中，一些GRF基因形成相关姐妹对，如LrGRF4和7，LrGRF8和14，OsGRF10和12，ZmGRF4和10，ZmGRF3和9，ZmGRF5和6，ZmGRF8和13，ZmGRF12和14，AtGRF1和2，AtGRF3和4，AtGRF5和6等(图3)。综上所述，不同植物的GRF家族成员经历了不同的进化过程，且与其他模式植物相比，LrGRF蛋白与SlGRF蛋白的关系更加密切。

2.3 不同盐胁迫下LrGRF基因的表达谱分析

为初步分析黑果枸杞GRF基因的功能，在NaCl处理下对叶和根不同组织器官的14个LrGRFs基因表达情况进行分析。结果表明，不同LrGRF基因在不同组织器官中的表达量存在明显差异。在叶部组织中多数基因在盐胁迫下表达较为活跃，其中LrGRF9和LrGRF4表达量较低，属于盐胁迫诱导下调的基因，推测这两个基因可能受到盐胁迫的抑制；在根部组织中LrGRF6，LrGRF10，LrGRF12和LrGRF14在盐处理不同时段下表达量较高，属于胁迫诱导上调的基因，LrGRF2和LrGRF3在无盐胁迫时根部的FPKM值较高，在L50-1 h的根部FPKM值降低，属于盐胁迫诱导下调的基因，在L250-1 h的根部FPKM值接近于对照，属于高盐胁迫下表达无差异的基因，LrGRF1，LrGRF4，LrGRF7，LrGRF9，LrGRF11和LrGRF13在盐胁迫下降低，属于盐胁迫诱导下调的基因(图4)。LrGRF2和LrGRF12在叶部组织中总体呈升高趋势，在根部中表达量呈现先下降后上升再下降的趋势；说明LrGRF2和LrGRF12在黑果枸杞的叶部组织的盐胁迫过程中可能起到重要作用(图5)。综上所述，与对照相比，黑果枸杞中LrGRF2，LrGRF6，LrGRF10和LrGRF12表达量高，揭示它们在响应黑果枸杞盐胁迫的过程中发挥重要的功能。

图4 LrGRF基因在黑果枸杞不同组织中的表达模式Fig.4 Expression patterns of LrGRF gene in different tissues of L.ruthenicum注：L=leaf;R=root。R50-1=50 mmol·L-1NaCl处理下1小时所取根样；L50-1=50 mmol·L-1 NaCl处理下1小时所取叶样；R250-1=250 mmol·L-1 NaCl处理下1小时所取根样；L250-1=250 mmol·L-1NaCl处理下1小时所取叶样；R50-12=50 mmol·L-1 NaCl处理下12小时所取根样；L50-12=50 mmol·L-1NaCl处理下12小时所取叶样；R250-12=250 mmol·L-1NaCl处理下12小时所取根样；L250-12=250 mmol·L-1NaCl处理下12小时所取叶样，R0=CK根；F0=CK叶Note:R50-1=50 mmol·L-1of NaCl treatment 1 hour root sample;L50-1=50 mmol·L-1of NaCl treatment 1 hour leaf sample;R250-1=250 mmol·L-1NaCl treatment 1 hour root sample;L250-1=250 mmol·L-1NaCl reatment 1 hour leaf sample;R50-12=50 mmol·L-1NaCl treatment 12 hours root sample;L50-12=50 mmol·L-1L NaCl treatment 12 hours leaf sample;R250-12=250 mmol·L-1NaCl treatment 12 hours root sample;L250-12=250 mmol·L-1NaCl treatment 12 hours leaf sample;R=root treatment control;L0:leaf treatment control

图5 LrGRF基因响应盐处理的表达分析Fig.5 Expression analysis of LrGRF gene in response to salt treatment

3 讨论

GRF转录因子在植物生长发育过程中起着重要作用[36]。近年来，不同植物的GRF转录因子成员及遗传功能已经得到了鉴定。但黑果枸杞GRF转录因子的研究还鲜有报道。本研究利用现有的黑果枸杞转录组数据鉴定了14个GRF，并对其家族成员特征进行了系统的分析。为进一步研究黑果枸杞GRF家族成员的功能提供了丰富的理论基础。

保守结构域的验证是基因家族的核心，在基因中具有重要功能。通过多序列比对与保守基序分析，除LrGRF14基因，其余LrGRFs基因至少含有两个或两个以上的motif；LrGRF14仅含QLQ结构域，其他家族成员含有WRC结构域和其他结构域，由此推测这13个蛋白质功能具有多样性。LrGRFs蛋白序列含有QLQ与WRC保守结构域，这与拟南芥[37]、水稻[38]、油菜[39]等蛋白序列结构高度相似，且在黑果枸杞中，WRC结构域的稳定性更高一些。结合进化树分析，同一亚族的LrGRFs基因具有非常相似的保守基序，这表明黑果枸杞GRF基因具有高度保守的蛋白质结构。这进一步验证了LrGRFs各序列之间的保守性和进化树亚族分类的精准度，有利于进一步分析黑果枸杞中GRF家族功能。同时在黑果枸杞中发现有两个基因包含两个WRC结构域是LrGRF2和LrGRF9，这在拟南芥、油菜和番茄中也有发现[7,17,39]，同时LrGRF4，LrGRF5和LrGRF7包含2个FFD结构域。此外，位于同一亚族的LrGRFs基因其Motif组成及排列顺序基本相同，这与香蕉[40](Musaparadisiaca)、葡萄[41](VitisviniferaL.)和番茄[17](SolanumLycopersicum)等GRF转录因子中的结果类似。这意味着LrGRFs的分类得到了保守基序的进一步支持，同时也说明了亚族成员间序列的高度保守性。

通过系统发育分析将14个LrGRFs分为7个亚族(图3)，这与GRF家族中其他高等植物的分类结果一致，如番茄[17]和棉属[42](Gossypium)等。除Ⅲ亚族外，其余亚族含有拟南芥、番茄与水稻的GRF基因家族成员，表明黑果枸杞与拟南芥、番茄之间可能具有类似的进化轨迹，且在对比五种不同的植物GRF基因家族进化分析，结果显示黑果枸杞与番茄的同源性最高，表明黑果枸杞与番茄在进化中有相近的起源关系。但黑果枸杞GRF基因在进化上又表现出差异性，暗示了其基因功能的多样性。通常，位于同一亚族的基因可能具有相似的功能，因此可以通过基因家族成员的亚族分类来预测同一分支上其他基因的功能。基因表达谱可以帮助研究人员进一步探索植物物种的生物学特性(抗逆性、发育调控和亚族组织特异性)，为后续的功能研究奠定基础[43-44]。

从结果分析来看，黑果枸杞中大部分LrGRF的表达量与对照组相比在盐胁迫下有所提高，且在根部组织和叶部组织有不同的表达模式。其中LrGRF6、LrGRF10和LrGRF12在根中高表达，而LrGRF2，LrGRF6和LrGRF10在叶中表现为高表达。在番茄中SlGRF2和SlGRF3基因在盐胁迫显著上调，表明其参与盐胁迫的调控过程[17]，因此推测黑果枸杞的LrGRF2，LrGRF8和LrGRF14参与盐胁迫的调控。AtGRF7与LrGRF10位于同一亚族的分支，推测LrGRF10可能参与对NaCl胁迫抗性的负调控过程[15]。在番茄中SlGRF4在处理后3 h显著上调从而参与盐胁迫的过程[17]，推测黑果枸杞的LrGRF6基因有相同的作用。因此，这些LrGRFs可以作为提高作物抗盐性的候选基因，但还需要进一步的研究来揭示LrGRF在盐胁迫下的分子机制。

4 结论

综上所述，黑果枸杞在盐胁迫下的转录组中筛选出14个LrGRF家族基因，并进一步分析了理化性质、系统发育关系和表达谱模式，以预测它们可能的生物学功能。多序列比对发现基因家族成员含有QLQ和WRC保守结构域。系统发育关系分析显示LrGRF可以分为7个亚族。LrGRFs基因的组织表达谱中LrGRF6、LrGRF10和LrGRF12在根中高表达，而LrGRF2，LrGRF6和LrGRF10在叶中表现为高表达，揭示它们在黑果枸杞组织中的生物学功能。该结果为进一步研究黑果枸杞及GRF家族成员的潜在功能提供参考。