兔金黄色葡萄球菌的分离鉴定和耐药性分析

谢 辉 ， 刘玉梅 ， 张 昕 ， 孙莹莹 ， 常赵阳 ， 张自强

(河南科技大学动物科技学院 ， 河南 洛阳 471023)

兔葡萄球菌病是家兔养殖中的常见疾病，由金黄色葡萄球菌感染引起。该病在一年四季均可发生，尤其在温暖潮湿的季节多发[1]。当家兔被金黄色葡萄球菌感染时，常见症状为家兔的乳房炎、脚皮炎和皮下脓肿[2-4]等，严重时可导致全身性感染，并迅速死亡[5]。哺乳母兔乳房感染金黄色葡萄球菌时，仔兔吸食乳汁会引发初生仔兔肠炎和仔兔黄尿病[6-7]，给养殖户造成了巨大的经济损失。本试验通过对某兔场送来的死亡哺乳母兔进行病理剖检，初步判断为金黄色葡萄球菌感染。为了进一步确定该病病原，无菌采集病兔的皮下脓肿、肝脏、脾脏等组织进行细菌的分离培养。通过分离菌的菌落形态、染色镜检、16S rDNA基因序列分析，最终确定致病菌为金黄色葡萄球菌，同时对分离菌进行药敏试验，以期对兔葡萄球菌病的诊治提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源 患病母兔来自洛阳某兔场，发病兔主要表现为拉水样稀粪、消瘦、沉郁。病兔送到实验室后进行病理剖检，并采集样品进行细菌的分离纯化和鉴定。

1.2 试剂仪器 普通琼脂培养基、LB液体培养基、麦康凯培养基，均购自杭州百思有限公司；红霉素、麦迪霉素、卡那霉素、复方新诺明、氨苄西林、丁胺卡那、头孢氨苄、头孢呋辛、呋喃唑酮、羧苄西林、哌拉西林、诺氟沙星、多黏菌素B、多西环素、庆大霉素和新霉素共16种抗生素药敏片，均购自比克曼生物公司；PremixTaqTM(ExTaqTMVersion 2.0 plus dye),购自大连TaKaRa公司；溴化乙锭溶液，购自苏州天可贸易有限公司；细菌基因组DNA小量提取试剂盒、DL2 000 Marker、Proteinase K，均购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.3 细菌分离培养 无菌采集病兔的肺脏、肝脏、脾脏等，划线接种于普通琼脂培养基和麦康凯培养基。在37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察菌落的生长情况，挑取典型单个菌落在LB液体培养基中进行纯化培养。

1.4 细菌形态学检测 将纯化后的菌液涂片、固定。之后用革兰染色试剂染色，在光学显微镜下对细菌的形态进行观察。

1.5 引物设计与合成 根据GenBank上公布的金黄色葡萄球菌16S rDNA基因序列设计引物，由安徽通用生物公司合成，预扩增的片段长度约为480 bp。引物信息见表1。

表1 PCR扩增引物信息

1.6 16S rDNA序列扩增 按照细菌基因组DNA小量提取试剂盒说明书的步骤提取分离菌的DNA。以分离菌的基因组为模板，利用设计的特异性引物在PCR仪内进行目的基因的扩增。反应条件：94 ℃变性 4 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 10 min。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。将特异性扩增产物送至通用生物实验公司测序，并在NCBI数据库进行对比分析。

1.7 药敏试验 按照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的K-B纸片法进行操作和结果判断(2005年修订版)。选取16种抗生素纸片对分离纯化的细菌进行药敏试验。取200 μL菌液涂布于普通琼脂平板，均匀地在平板上贴上药敏片。37 ℃培养24 h后测量抑菌圈直径，测量3次取平均值。

2 结果

2.1 剖检变化 对病兔剖检时发现，病兔腹腔有大量淡黄色积液，皮下有白色肿块(图1A)；肺脏肿大、出血(图1B)；肝脏出血、肿大，表面附着有白色脓性物质(图1C)；脾脏肿大，呈蓝紫色(图1D)。

图1 病兔病理剖检

2.2 分离菌的形态观察 从患病母兔的皮下脓性物质和肺脏等组织中分离到菌落形态一致的菌株，37 ℃恒温培养24 h后，分离菌在普通琼脂培养基上形成中等大小、圆形湿润的微黄色菌落。革兰染色后可在光镜下观察到蓝紫色、呈单个、双或串状排列的革兰阳性球菌(图2)。

图2 细菌形态学观察

2.3 PCR鉴定 利用特异性引物分别对从肺脏、肝脏、脾脏中分离培养的菌株进行PCR扩增，分离菌16S rDNA基因产物约480 bp，长度与预期相符(图3)。由PCR鉴定结果证实分离菌为金黄色葡萄球菌。

图3 分离菌16S rDNA的PCR扩增

2.4 分离菌基因序列分析 将PCR扩增后的产物经BLAST进行分析，分析结果显示分离菌株和金黄色葡萄球菌的同源性最高，采用MEGA 7．0软件构建遗传进化树，分离菌与金黄色葡萄球菌(登录号为MN843752.1)的同源性为97%(图4)。

图4 16S rDNA基因系统发育树

2.5 药敏试验 分离菌对不同药物的敏感性结果见表2。由表2可知，分离菌对羧苄西林、哌拉西林、诺氟沙星、多黏菌素B、多西环素、庆大霉素、新霉素7种药物敏感，对红霉素、麦迪霉素、卡那霉素、复方新诺明、氨苄西林、丁胺卡那、头孢氨苄、头孢呋辛、呋喃唑酮具有耐药性。

表2 不同药物对金黄色葡萄球菌菌株的抑菌效果

3 讨论

兔葡萄球菌病已成为家兔养殖中的常见疾病之一，因其感染部位和菌株的毒力大小不同呈现不同的病理变化。在以往的研究中，被金黄色葡萄球菌感染的成年家兔多以皮下和组织器官脓肿为主要特征[4,8]。赵蕾等[9]研究显示，被金黄色葡萄球菌感染的家兔除了形成脓肿，还具有拉稀粪、流鼻涕、肺脏和气管出血等症状。王华等[10]给健康的家兔接种金黄色葡萄球菌，可导致家兔出现脾脏肿大、肝脏出血肿大、皮肤溃疡等病理特征。本试验病兔的临床症状和剖检结果与上述研究相似，但同时也出现了病兔腹腔积液、腹部被毛潮湿等症状。因为金黄色葡萄球菌感染家兔所引起的临床症状和病理特征既具有广泛性，又具有复杂性，致使当金黄色葡萄球菌单独感染或和其他致病菌混合感染家兔时，仅以临床观察和病理剖检难以准确判断致病原，因此采用分子生物学手段对分离菌16S rDNA序列进行鉴定是很有必要的。

针对金黄色葡萄球菌感染，临床上主要依赖于抗菌药物进行治疗。但随着抗生素的长期大量使用，导致了金黄色葡萄球菌的耐药性不断增加，给本病的防治造成了极大的困难。抗菌药物使用造成的选择性压力是细菌耐药的关键因素[11],耐药性金黄色葡萄球菌可以产生能水解β-内酰胺环的青霉素酶，从而使抗菌药物失效[12-13]。随着耐药基因在金黄色葡萄球菌中的传播，致使兔源性金黄色葡萄球菌多重耐药性趋势上升。根据邓钊宾等[14]的报道，从四川地区部分规模化兔场分离出的41株金黄色葡萄球菌株对β-酰胺类、大环内脂类、四环素类、氨基糖苷类药物的耐药率较高，其中29株具有多重耐药性。侯景等[15]对取自四川某兔场的1株兔肺源金黄色葡萄球菌进行药敏试验，发现分离菌株具有多重耐药性，仅对头孢噻吩、头孢拉定、头孢哌酮、哌拉西林4种药物敏感，对其他测试药物均耐药。金黄色葡萄球菌可因动物源性和地域的不同而使耐药性存在差异，如张国权等[16]的研究显示从獭兔中分离到的金黄色葡萄球菌菌株对阿米卡星、阿莫西林、头孢曲松和头孢哌酮敏感，对链霉素、庆大霉素、多黏菌素B等7种药物耐药。而在本试验中，药敏试验结果与张国权等的结果具有一定差异，这可能是由于不同地区抗生素的使用情况不同导致，但具体原因仍需进一步探究。细菌对某种抗生素耐药率的变化，不仅与该种抗生素的用量有关，和其他种药物的使用也具有一定的相关性[17]。因此，为了防止肉兔生产中抗生素的滥用，减少耐药菌株的产生，有必要对病原菌进行分离培养和耐药性检测。在选择药物时，可根据药敏试验结果选择敏感药物进行治疗，以期取得最好的治疗效果。在用药的同时，也要对兔舍和笼具进行严格消毒，防止病原在兔群中的传播。