敲低mGluR5通过激活PI3K/AKT信号通路减轻阿尔茨海默病相关病变*

魏雪敏， 陈秋旋， 陈玉钊， 张一霖， 吴美建， 张珂珂， 魏伟△

·论著·

敲低通过激活PI3K/AKT信号通路减轻阿尔茨海默病相关病变*

魏雪敏1， 陈秋旋1， 陈玉钊1， 张一霖1， 吴美建1，2， 张珂珂1， 魏伟1△

（1暨南大学基础医学与公共卫生学院病理生理学系，国家中医药管理局病理生理科研实验室，广东 广州 510632；2广州医科大学附属第二医院转化医学中心，广东 广州 510260）

探讨敲低代谢型谷氨酸受体5（metabotropic gultamate receptor 5，）对6月龄5xFAD小鼠β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein， Aβ）病变、突触结构和神经炎症的影响及其潜在机制。选取2、6和12月龄的野生型（wild-type， WT）和5xFAD小鼠，用Western blot检测不同阶段小鼠海马组织中mGluR5蛋白的表达情况。取6月龄的WT、5xFAD、mGluR5和5xFAD/mGluR5小鼠脑组织，免疫荧光染色检测Aβ斑块的聚集，Western blot检测海马组织中淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein， APP）和p-APP蛋白水平，海马组织透射电子显微镜观察突触的超微结构，Western blot检测海马组织中突触蛋白、炎症因子和mGluR5下游磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）/AKT信号通路相关蛋白的表达。（1）随着月龄的增加，5xFAD小鼠海马组织中mGluR5的表达显著增加（<0.01）；（2）敲低减少了5xFAD小鼠海马区Aβ斑块，降低了APP和p-APP蛋白水平（<0.05）；（3）敲低减轻了5xFAD小鼠海马的突触结构损伤，5xFAD/mGluR5小鼠突触前标志物突触小泡蛋白（synaptophysin， SYP）和突触后标志物突触后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95， PSD95）表达显著高于5xFAD小鼠（<0.05），而树突标志物微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2， MAP2）和神经元标志物神经元核抗原（neuronal nuclear antigen， NeuN）表达无显著差异；（4）敲低可降低5xFAD小鼠的神经炎症反应，减少炎症因子的释放；（5）5xFAD小鼠敲低可通过激活PI3K/AKT信号通路发挥神经保护作用，还通过抑制糖原合成酶激酶3β（glycogen synthetase kinase-3β， GSK-3β）/κB抑制因子激酶（inhibitor of κB kinase， IKK）/核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）炎症信号通路减轻神经炎症反应。敲低可以减轻6月龄5xFAD小鼠的Aβ病变、突触结构损伤和神经炎症，其机制可能与PI3K/AKT及其下游GSK-3β/IKK/NF-κB信号通路有关。

阿尔茨海默病；代谢型谷氨酸受体5；β-淀粉样蛋白；神经炎症；突触

阿尔茨海默病（Alzheimer disease， AD）是最常见的痴呆形式，是一种慢性进行性发展的中枢神经系统退行性疾病，表现为记忆损失，认知障碍，行为能力减退并伴有各种情绪改变等症状［1］。2021年世界阿尔茨海默病协会报告显示，全球超过8 000万人患痴呆症，预计到了2050年，患痴呆症人数将达到1.52亿。目前，中国是全球AD患者人数最多的地区，是全球增长速度最快的地区之一。AD已成为严重威胁老龄人的常见疾病，这给亲属和社会都带来了沉重的负担。细胞外β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein， Aβ）聚集形成的老年斑和细胞内tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles， NFTs）［2-3］，以及伴随的突触功能障碍和胶质细胞增生［4］，构成了AD的神经病理学特征。

谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中最丰富的兴奋性神经递质，调节学习记忆、突触可塑性和神经元发育。谷氨酸受体有两种类型：离子型谷氨酸受体和代谢型谷氨酸受体。离子型谷氨酸受体主要包括NMDA受体和AMPA受体，针对离子型谷氨酸受体在AD的病理生理过程中的机制已有大量的研究。其中，NMDA受体拮抗剂“美金刚”已作为AD的治疗用药，但该药物也存在一些不足，长期使用会引起记忆丧失、镇静、共济失调并且损害兴奋性突触传递［5］。而代谢型谷氨酸受体在AD发病过程中的作用仍需进一步研究。

代谢型谷氨酸受体（metabotropic gultamate receptors， mGluRs）可被分成3个亚组，包括Ⅰ组（mGluR1和mGluR5）、Ⅱ组（mGluR2和mGluR3）和Ⅲ组（mGluR4、6、7和8）。在这8个mGluRs中，mGluR5在脑皮质和海马中高度表达［6］，提示其在AD等认知功能障碍相关疾病中具有重要作用。研究表明，mGluR5可以作为Aβ/细胞朊病毒蛋白（cellular prion protein， PrPc）复合物的细胞外支架，导致细胞内Ca2+的过度释放和神经毒性［7］。在AD模型小鼠中，mGluR5药物抑制可防止记忆丧失，减少Aβ相关神经病理发生［8］。综上，提示mGluR5在AD发病机制中是一个不可忽视的因素，但仍缺少证据阐明mGluR5与AD病理变化的关系。本研究主要观察mGluR5在AD模型不同阶段的表达变化，并通过敲低探讨其对AD模型小鼠Aβ病理、突触结构和神经炎症的作用，为AD的治疗提供参考资料。

材料和方法

1　实验动物

5xFAD小鼠是携带5个家族性基因突变的转基因AD模型小鼠。这一品系的小鼠具有高淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein， APP）表达，并伴有Aβ的加速聚集。SPF级C57BL/6背景的5xFAD小鼠，由深圳市疾病控制与研究中心馈赠；SPF级B6.129-tm1Rod/J小鼠，是C57BL/6背景的基因敲低小鼠，其缺乏（以下简称mGluR5小鼠），购自Jackson Laboratory，许可证号为：AA1119000057；SPF级C57BL/6小鼠作为野生型（wild-type， WT）对照小鼠，购自福贝斯（北京）生物科技有限公司，许可证号为SCXK（京）2019-0010；5xFAD小鼠与B6.129-tm1Rod/J小鼠杂交，通过基因鉴定获得5xFAD/mGluR5小鼠。动物饲养于暨南大学实验动物中心，自由饮水进食，室温为（22±2） ℃，相对湿度为40%～60%，光照/黑暗周期为12 h（8：00～20：00）。实验操作严格按照暨南大学实验动物伦理委员会的相关规定进行。

2　主要仪器及试剂

主要仪器：透射电子显微镜（HITACHI）；智能倒置荧光显微镜（Leica）。主要试剂：鼠尾直接PCR试剂盒（Bimake）；DAPI（Thermo Scientific）；Alexa Flour 647荧光Ⅱ抗和Alexa Fluor 488荧光Ⅱ抗（Millipore）；抗APP、p-APP、突触后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95， PSD95）、突触小泡蛋白（synaptophysin， SYP）、微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2， MAP2）、神经元核抗原（neuronal nuclear antigen， NeuN）、胶质细胞原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein， GFAP）、离子钙结合接头分子1（ionized calcium-binding adaptor molecule-1， IBA-1）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白细胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）、PI3K P110、PI3K P85、AKT、p-AKT、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthetase kinase-3β， GSK-3β）、p-GSK-3β、κB抑制因子激酶（inhibitor of κB kinase， IKK）、p-IKK、核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB） P65、p-P65及GAPDH抗体均购自Cell Signaling Technology；辣根过氧化酶标记的羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗（鼎国生物科技有限公司）。

3　实验分组

为了研究不同阶段小鼠海马组织中mGluR5蛋白的表达情况，将动物分为6组：2月龄［体重（20±2.5） g］、6月龄［体重（28±2.5） g］和12月龄［体重（30±2.5） g］雄性WT或5xFAD小鼠，每组3只。动物分组遵循对照和随机的原则。

为了研究敲低对6月龄5xFAD小鼠的影响，将动物随机分为4组：WT、mGluR5、5xFAD和5xFAD/mGluR5，每组9只，体重（28±2.5） g，分别用于免疫荧光检测、透射电子显微镜制片及观察和Western blot实验，动物分组遵循对照和随机的原则。

4　实验方法

4.1基因鉴定（1）消化组织：剪小鼠鼠尾3 mm，剪碎组织，加入配好的消化液50 µL，55 ℃水浴消化30 min，消化完成后再95 ℃水浴5 min灭活蛋白酶，4 ℃离心10 min，取上清于-20 ℃保存。（2）PCR扩增：配制PCR 50 µL反应体系。反应条件为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环36次。（3）琼脂糖凝胶电泳：提前配制好琼脂糖凝胶，PCR完成后，取出样品，每个孔10 µL点样，280 V恒压电泳，20 min。（4）用凝胶成像仪或紫外成像仪观察结果。

4.2冰冻切片小鼠经异氟烷吸入麻醉后，固定在手术台上，剪开胸腔暴露心脏，心脏灌注常温的生理盐水，观察灌流液的颜色从深红逐渐变浅直至无色透明时灌注完成；剪开小鼠脑部皮肤及硬脑膜暴露出脑组织，取出全脑组织放入4%多聚甲醛溶液中浸泡固定48 h，再分别用梯度10%、20%和30%的蔗糖溶液脱水各24 h；取出脱水完成的脑组织吸干水分，用OCT包埋，冰冻切片机提前预冷置至-20 ℃，矢状切面，切片厚度为20 μm，从海马组织出现开始连续切片，至第8张开始连续切片20张，贴片保存。

4.3免疫荧光取具有相同部位的组织切片，室温复温30 min，加入1% TritonX-100溶液室温破膜30 min，PBS洗3次，3% BSA室温封闭1 h，PBS洗3次，加入相应Ⅰ抗均匀覆盖脑片，4 ℃冰箱中孵育过夜，PBS洗3次，加入Ⅱ抗室温避光孵育1 h，PBS洗3次，加入DAPI染核5 min，PBS洗3次，滴加防淬灭剂，封片保存，显微镜下观察。

4.4透射电镜制片及观察（1）取材固定：取新鲜小鼠海马组织，迅速浸没在电镜固定液中，4 ℃固定3 h，0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗3次，每次15 min。（2）后固定：在1%锇酸室温固定2 h；0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗3次，每次15 min。（3）脱水：组织依次放入50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇、100%丙酮、100%丙酮溶液中进行脱水，每次15 min。（5）浸透：将组织置于丙酮∶包埋剂=1∶1，室温3 h；丙酮∶包埋剂=1∶2，室温渗透过夜；纯包埋剂，室温7 h；将纯包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后于37 ℃烤箱中过夜。（6）聚合：将组织置于60 ℃烤箱中聚合48 h。（7）切片：用超薄切片机切成60～80 nm超薄切片。（8）染色：铀铅双染色（2%醋酸铀饱和乙醇溶液，枸橼酸铅，各染色15 min），切片室温干燥过夜。（9）透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

4.5Western blot实验取小鼠海马组织，加入500 µL裂解液充分裂解组织，将样品放入组织匀浆机中研磨5次，每次120 s，每次间隔10 s，频率60 Hz；4 ℃离心10 min，取上清液，使用BCA法检测蛋白浓度，调整蛋白浓度，加入上样缓冲液，100 ℃ 10 min后于-20 ℃保存，或直接用于Western blot实验；样品经8%、10%或12%的SDS-PAGE分离，NC膜转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，4 ℃环境下Ⅰ抗孵育过夜，TBST洗3次，每次10 min，使用相应的Ⅱ抗室温孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，ECL化学发光法显影，ImageJ图像分析软件测量条带灰度值。

5　统计学处理

实验数据以均数±标准差（mean±SD）表示。使用软件GraphPad Prism 9.0进行统计及图表绘制。采用Kolmogorov-Smirnov检验确定数据的正态性。两组之间比较采用检验，多组之间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey多重比较检验。以<0.05为差异有统计学意义。

结果

1　5xFAD小鼠mGluR5的表达随着年龄的增加而增加

不同月龄小鼠海马组织中mGluR5的表达如图1A所示。随着月龄的增加，mGluR5的表达呈现增加的趋势。在6月龄和12月龄时，5xFAD小鼠mGluR5的表达相较于同龄WT小鼠显著升高（<0.01）。敲低后其蛋白的表达如图1B所示。相较于WT小鼠，mGluR5小鼠mGluR5的表达显著降低（<0.01）；较于5xFAD小鼠，5xFAD/mGluR5小鼠mGluR5的表达同样显著降低（<0.01）。

Figure 1.　The expression of mGluR5 in different stages of 5xFAD mice. A： the expression of mGluR5 in the hippocampus of 2-， 6- and 12-month-old 5xFAD and WT mice； B： the expression of mGluR5 in the hippocampus of 6-month-old WT，mGluR5+/-， 5xFAD and 5xFAD/mGluR5+/- mice. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs WT group；##P<0.01 vs 5xFAD group.

2　敲低mGluR5减少5xFAD小鼠Aβ的聚集

敲低对5xFAD小鼠Aβ病变影响的结果如图2A所示。WT和mGluR5小鼠海马区均无Aβ的表达，但在5xFAD小鼠海马区检测到有大量Aβ斑块聚集，而5xFAD/mGluR5小鼠海马区Aβ斑块面积相较于5xFAD小鼠显著缩小（<0.01）。小鼠海马组织中APP的表达和磷酸化修饰情况如图2B所示。与5xFAD小鼠相比，5xFAD/mGluR5小鼠APP和p-APP（Thr688）的蛋白水平显著降低（<0.05）。

Figure 2.　Knockdown of mGluR5 reduced Aβ aggregation in the hippocampus of 6-month-old 5xFAD mice. A： Aβ plaques （4G8， red） decreased in the hippocampus of 6-month-old 5xFAD/mGluR5+/- mice compared with 5xFAD mice （scale bar=250 μm）； B： the protein levels of APP and p-APP （Thr688） in the hippocampus of 6-month-old WT，mGluR5+/-， 5xFAD and 5xFAD/mGluR5+/- mice. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs WT group；#P<0.05，##P<0.01 vs 5xFAD group.

3　敲低mGluR5改善5xFAD小鼠的突触结构

电子显微镜观察小鼠海马的突触结构如图3A所示。WT小鼠突触基本结构清晰，突触小泡丰富，前膜、后膜清晰，突触间隙宽度适中；mGluR5小鼠突触基本结构略模糊，突触小泡数量一般，前膜、后膜大部分略模糊，突触间隙宽度适中；而5xFAD小鼠突触基本结构模糊，突触小泡不丰富，前膜、后膜模糊不清，突触间隙不可见；5xFAD/mGluR5小鼠的突触结构和突触间隙均有一定程度的改善，其突触基本结构清晰，突触小泡丰富，前膜、后膜大部分清晰，突触间隙宽度适中。如图3B所示，与WT小鼠相比，5xFAD小鼠中突触前标志物SYP和突触后标志物PSD95的表达均显著降低（<0.01）；与5xFAD小鼠相比，5xFAD/mGluR5小鼠SYP和PSD95的表达均显著升高（<0.05）。神经元标志物NeuN和树突标志物MAP2的表达在各组小鼠之间均无显著差异，见图3B。

Figure 3.　Knockdown of mGluR5 attenuated damage to synaptic structure in 6-month-old 5xFAD mice. A： high-magnification electron micrographs showed that the synaptic structure and the synaptic gap in 5xFAD/mGluR5+/- mice were recovered （PD： postsynaptic membrane； SC： synaptic cleft； M： mitochondria； PM： presynaptic membrane； SV： synaptic vesicles； SJ： synaptic corpuscles； scale bar=500 nm）； B： the expression of PSD95， SYP， MAP2 and NeuN in the hippocampus of 6-month-old WT，mGluR5+/-， 5xFAD and 5xFAD/mGluR5+/- mice. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs WT group；#P<0.05，##P<0.01 vs 5xFAD group.

4　敲低mGluR5减轻5xFAD小鼠的神经炎症反应

星形胶质细胞标志物GFAP、小胶质细胞标志物IBA-1及炎症因子TNF-α和IL-1β的表达如图4A所示。与WT小鼠相比，5xFAD小鼠的GFAP、IBA-1、TNF-α和IL-1β的表达均显著升高（<0.01）；然而相较于5xFAD小鼠，5xFAD/mGluR5小鼠的GFAP、IBA-1、TNF-α和IL-1β表达均显著降低（<0.05）。小鼠脑组织中GFAP的形态变化如图4B所示。相较于WT小鼠，5xFAD小鼠GFAP的荧光面积显著升高（<0.01）；与5xFAD小鼠相比，5xFAD/mGluR5小鼠GFAP表达降低（<0.05）。

Figure 4.　Knockdown of mGluR5 reduced neuroinflammation in 6-month-old 5xFAD mice. A： the expression of GFAP， IBA-1， TNF-α and IL-1β in 6-month-old WT，mGluR5+/-， 5xFAD and 5xFAD/mGluR5+/- mice； B： GFAP （red） immunofluorescence in the hippocampus of 6-month-old mice （scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=3. **P<0.05 vs WT group；#P<0.05，##P<0.01 vs 5xFAD group.

5　敲低mGluR5激活5xFAD小鼠PI3K/AKT信号通路，抑制炎症通路

mGluR5下游相关信号通路PI3K/AKT的表达和修饰如图5A所示。与5xFAD小鼠相比，5xFAD/mGluR5小鼠中PI3K调节亚基P85和AKT的磷酸化水平均显著升高（<0.01），然而PI3K催化亚基P110的表达无显著差异。GSK-3β、IKK和NF-κB P65的表达和修饰如图5B所示。与5xFAD小鼠相比，5xFAD/mGluR5小鼠p-GSK-3β （Tyr216）的蛋白水平显著降低（<0.01）；与5xFAD小鼠相比，5xFAD/mGluR5小鼠p-IKK和p-P65的蛋白水平均显著降低（<0.01）。

Figure 5.　Knockdown of mGluR5 activated PI3K/AKT signaling pathway and inhibited inflammatory in 5xFAD mice. A： the protein levels of P110， P85， PI3K， p-AKT and AKT in the hippocampus of 6-month-old WT，mGluR5+/-，5xFAD and 5xFAD/mGluR5+/- mice； B： the protein levels of p-GSK3β， GSK3β， p-IKK， IKK， p-P65 and P65 in 6-month-old WT，mGluR5+/-，5xFAD and 5xFAD/mGluR5+/- mice. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs WT group；##P<0.01 vs 5xFAD group.

讨论

谷氨酸是一种兴奋性神经递质，在记忆，突触可塑性和神经元发育中起重要作用。NMDA受体拮抗剂“美金刚”已被用于中度至重度AD的治疗，但是一些副作用无法避免。mGluR5在大脑海马高表达，同时可以通过朊病毒蛋白与Aβ结合并激活细胞内FYN激酶以损害突触功能。有研究通过正电子发射断层扫描技术检测到在5xFAD小鼠中mGluR5表达增加［9］，我们的实验观察到mGluR5随着5xFAD小鼠月龄的增加而呈现Aβ的聚集增加，在6月龄后表达显著高于同龄野生对照小鼠，因此本研究选取6月龄小鼠展开实验。有研究报道，的遗传缺失可以改善APP/PS1ΔE9模型小鼠的认知功能并降低Aβ斑块和Aβ寡聚体浓度［10］。但我们观察到，完全敲除会引起小鼠重度抑郁并过早死亡。因此，本研究在5xFAD模型小鼠中敲低，研究其对AD相关病理是否有影响。

APP是由100多个氨基酸组成的蛋白，存在于生物体的多种组织中。Aβ是由APP经β-分泌酶和γ-分泌酶异常水解产生的，而APP在Thr668位点的磷酸化会加速这种生成［11］。Aβ的产生增加和聚集引起的神经毒性作用会损害神经系统的正常功能，导致学习记忆和认知功能障碍［12-13］。本研究观察到，6月龄5xFAD/mGluR5小鼠海马区APP磷酸化减少，Aβ斑块显著改善。APP的磷酸化修饰受GSK3β的调节，同时GSK3β的激活会导致β-分泌酶蛋白水平增加，磷酸化的APP被β-分泌酶错误切割产生过量Aβ［14］。本研究中5xFAD小鼠敲低mGluR5后GSK3β的活性抑制是Aβ斑块减少的可能机制。

AD患者脑内比神经元损伤更严重的是突触损伤和缺失，这是AD患者认知功能下降的一个病理特征［15］。电镜观察结果显示5xFAD小鼠的突触结构严重损伤，而在敲低后突触的形态结构有很大的改善。同时，5xFAD小鼠敲低后其突触蛋白SYP和PSD95的表达增高，而神经元和树突本身并未被影响。

PI3K/AKT信号通路是一条与增殖，分化和凋亡相关的信号通路，可以响应包括胰岛素、生长因子和细胞因子等各种刺激，发挥神经保护作用［16-17］。在AD脑中，Aβ的产生和聚集降低PI3K/AKT信号的磷酸化和活性［18］。本研究检测到5xFAD/mGluR5小鼠中该条通路被有效逆转，这可能是改善神经元突触结构，发挥神经保护作用的机制。

神经炎症被认为是包括AD在内的神经退行性疾病发病机制的一部分［19-20］。神经炎症的主要参与者是星形胶质细胞和小胶质细胞［21］，当它们激活后，这些细胞会产生炎症细胞因子和趋化因子，从而维持和增强炎症状况。异常的胶质细胞增生会激活NF-κB，从而产生更多的神经炎症因子导致神经退行性变和认知功能障碍［22］。本研究显示，5xFAD/mGluR5小鼠海马组织中炎症因子TNF-α和IL-1β的表达显著低于5xFAD小鼠，同时GFAP和IBA-1的表达也显著低于5xFAD小鼠。免疫荧光检测也观察到5xFAD/mGluR5小鼠相较于5xFAD小鼠，海马区GFAP的形态有所改善。这些结果表明，敲低5xFAD小鼠可以抑制胶质细胞的活化，下调炎症因子的表达，从而减轻神经炎症反应。

NF-κB是一种核转录因子，参与机体的炎症反应和免疫应答，调节细胞凋亡；IKK是NF-κB信号通路的主要调节因子，其受AKT的调控并可以激活NF-κB信号［23］。研究表明，GSK-3β可以通过IKK参与NF-κB信号通路［24］，同时GSK-3β也是PI3K/AKT信号通路的下游组分，研究表明PI3K/AKT信号通路激活后，抑制GSK3β，产生抗炎反应，而GSK3β在Tyr216位点的磷酸化增加，其活性状态促进NF-κB的活化，导致炎症因子的产生［25］。本研究观察到敲低后，6月龄5xFAD小鼠PI3K/AKT信号通路激活导致GSK-3β抑制，Try216位点磷酸化减少，抑制其下游的IKK/NF-κB炎症信号通路，减少TNF-α和IL-1β等炎症因子的释放，产生抗炎反应减少神经炎症。

综上所述，敲低5xFAD小鼠可显著减轻其在6月龄时的Aβ病变、突触结构损伤及神经炎症，这可能是通过激活PI3K/AKT信号通路和抑制GSK-3β/IKK/NF-κB信号通路分别参与发挥神经保护作用和抗炎反应实现的。

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knockdown attenuates Alzheimer disease-related pathology by activating PI3K/AKT signaling pathway

WEI Xue-min1， CHEN Qiu-xuan1， CHEN Yu-zhao1， ZHANG Yi-lin1， WU Mei-jian1，2， ZHANG Ke-ke1， WEI Wei1△

（1，，，，，510632，；2，，，510260，）

To explore the effects of metabotropic glutamate receptor 5 （） knockdown on amyloid β-protein （Aβ） pathology， synaptic structure and neuroinflammation in 6-month-old 5xFAD mice and its underlying mechanism.Wild-type （WT） and 5xFAD mice aged 2， 6 and 12 months were selected to detect the expression of mGluR5 protein in the hippocampus by Western blot. Six-month-old WT， 5xFAD，mGluR5and 5xFAD/mGluR5mice were selected to explore the role of mGluR5 in Alzheimer disease-related pathology. The expression and aggregation of Aβ plaques were detected by immunofluorescence. The protein levels of amyloid precursor protein （APP） and p-APP in hippocampus were detected by Western blot. The ultrastructure of the synapse was observed by transmission electron microscopy. The expression levels of synaptic proteins， inflammatory factors and phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）/AKT signaling pathway-related proteins in hippocampus were detected by Western blot.（1） The expression of mGluR5 in the hippocampus of 5xFAD mice increased with age （<0.01）. （2） Knockdown ofreduced Aβ plaques （<0.01）， and decreased the protein levels of APP and p-APP in the hippocampus of 5xFAD mice（<0.05）.（3） Knockdown ofattenuated synaptic structural damage in the hippocampus of 5xFAD mice. The expression levels of presynaptic marker synaptophysin （SYP） and postsynaptic marker postsynaptic density protein 95 （PSD95） in 5xFAD/mGluR5mice were significantly higher than those in 5xFAD mice （<0.05）， while the expression of dendritic marker microtubule-associated protein 2 （MAP2） and neuron marker neuronal nuclear antigen （NeuN） had no statistically significant difference. （4） Knockdown ofreduced neuroinflammation in 5xFAD mice. （5） Knockdown ofin 5xFAD mice exerted neuroprotective effect by activating PI3K/AKT signaling pathway， and reduced neuroinflammation by inhibiting glycogen synthetase kinase-3β （GSK-3β）/inhibitor of κB kinase （IKK）/nuclear factor-κB （NF-κB） signaling pathway.Knockdown ofattenuated Aβ pathology， synaptic damage and neuroinflammation in 6-month-old 5xFAD mice， and its mechanism may be related to PI3K/AKT and its downstream GSK-3β/IKK/NF-κB signaling pathways.

Alzheimer disease； Metabotropic glutamate receptor 5； Amyloid β-protein； Neuroinflammation； Synapse

R749.1+6； R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.06.001

1000-4718（2022）06-0961-09

2022-02-28

2022-05-24

国家自然科学基金资助项目（No. 81100944）；广东省自然科学基金资助项目（No. 2018A030313565）；广州市科技计划项目（No. 201904010040）

Tel： 020-85526259； E-mail： rocky1240@163.com

（责任编辑：李淑媛，余小慧）