基于网络药理学和分子对接技术探索丹参治疗习惯性流产潜在作用机制*

康宁，段晨晨，张清燕，3，岳静宇，3，刘银姣，李强，3

1.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000；2.洛阳市中医院，河南 洛阳 471000；3.河南省病毒性疾病中医药防治重点实验室，河南 郑州 450000

习惯性流产(habitual abortion)是指生育期妇女连续3次或3次以上的自然流产，其发病率约占妊娠妇女的1%[1]。近年来，国际上也采用复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)进行病情评估，其定义为连续两次或两次以上自然流产，发病率约为5%[2]。发病原因主要以内分泌紊乱、自身免疫因素、先天性染色体异常以及子宫畸形等。现阶段临床研究表明，该病常为多因素互相影响致病，故西医治疗未取得突破性进展。中医学认为习惯性流产属于“滑胎”“数堕胎”等范畴，其病因病机与肝郁气滞、肾虚血瘀、气血不足、脾肾两虚等有关，中医从整体观念出发，辨证施治，临床疗效可靠、安全性强[3]。研究显示，肾虚血瘀型习惯性流产的发病率占不明原因习惯性流产患者的82.3%[4]，因此探索该证型的临床治疗及机制研究具有重要的现实意义。

胚胎的形成和发育主要与肾、冲脉、任脉密切相关，频繁堕胎导致精血耗伤，进而引起肾阴亏虚和冲任二脉的损伤，而反复堕胎导致瘀血滞留胞中，再孕后又因精血聚于下以养胎，而聚于胞宫之精血会使血液运行的阻力增加，从而加剧瘀血的形成，瘀血不去则新血难生，不能养胎，致胎元难固而流产，最终形成肾虚血瘀病理机制[5-7]。另外，王永富等[8]认为“凡出血，必有瘀血”“血以流为贵，以滞为患”“瘀血不去，新血不得归经”“安胎必和血，血和胎自安”等，从而确定了活血、化瘀、补肾、安胎为主的治疗原则。丹参作为治疗肾虚血瘀型习惯性流产的代表用药，已被广泛应用于临床并取得较好疗效。丹参，苦，微寒，归心、心包、肝经，具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、除烦安神之功效[9]。丹参治疗习惯性流产的机制仍需进一步系统深入研究，因此利用网络药理学系统阐明丹参治疗肾虚血瘀型习惯性流产的作用机制，为丹参治疗习惯性流产的深入研究提供一定理论依据。

1 资料与方法

1.1 数据库及应用软件中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)数据库(http：//tcmspw.com)；Swiss Target Prediction 数据库 (http：//www.swisstargetprediction.ch/)；UniProt 数据(http：//www.Uniprot.org/)；人类基因(GeneCards)数据库(https：//www.genecards.org/)；人类孟德尔遗传(online mendelian inheritance in man，OMIM)数据库 (https：//omim.org/)；STRING数据库(https：//string-db.org/cgi/input.pl)；DAVID 6.8数据库(https：//david.ncifcrf.gov/)；Cytoscape 3.6.0软件；Open Babel软件；R studio软件。

1.2 化学成分收集通过TCMSP数据库及文献检索获得丹参的化学成分[10]。TCMSP数据库获得的化学成分以其吸收、分布、代谢、排泄(ADME)参数中的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%或类药性(Drug-likeness，DL)≥0.18为限制条件进行筛选。文献查阅获得的主要活性成分，通过TCMSP数据库获得ADME参数及Mol2格式的分子结构。

1.3 靶点获取TCMSP数据库查找活性成分作用靶点，检索Uniprot数据库将靶点名称校正为官方基因名称 (official gene symbol)。利用Open Babel软件将分子格式转换为sdf格式，导入Swiss Target Prediction预测靶点，剔除可能性为零的靶点。将TCMSP获取靶点与Swiss Target Prediction预测靶点进行合并，剔除重复和非人类靶点，取两者并集即为丹参活性成分作用靶点。

OMIM数据库、Genecard数据库检索关键词“recurrent spontaneous abortion”获取疾病靶点，合并两个数据库获得的疾病靶点，剔除重复，即获得习惯性流产的疾病靶点。

1.4 中药-活性成分-靶点-疾病网络图的构建活性成分靶点与疾病靶点进行映射取交集，获得丹参治疗“recurrent spontaneous abortion”的潜在作用靶点。将以上活性成分及靶点信息导入Cytoscape 3.6.0构建“中药-活性成分-靶点-疾病”关系网络图。

1.5 蛋白质相互作用(PPI)网络图的构建将活性成分对习惯性流产潜在作用靶点导入String数据库，选定物种Homo sapiens，置信度为0.99，剔除无相互作用靶点，获取蛋白质相互作用相关信息。利用Cytoscape 3.6.0中的Network Analyzer插件进行蛋白质互作网络分析。

1.6 基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析活性成分的潜在习惯性流产蛋白靶点导入DAVID 6.8数据库，选定物种为 Homo sapiens，对GO下的分子功能 (molecular function，MF)、生物过程 (biological process，BP) 和细胞组成 (cellular component，CC)，以及对KEGG Pathway进行分析。导出结果设定显著性为P<0.05，按照Count值进行筛选，获得富集显著的功能注释与疾病相关通路。

1.7 活性成分-作用靶点的分子对接选取PPI网络中排名前5位的靶点作为丹参治疗习惯性流产关键靶点，从PDB数据库 (http：//www.rcsb.org/) 获取关键靶点的3D结构 (PDB Format)，利用 Pymol 2.0软件对靶点蛋白进行去水、加氢、加电荷等处理，应用Lepro功能确定靶蛋白的结合位点。运用Ledock软件对丹参活性成分及其关键靶点进行分子对接，对接结果筛选阈值为-6 kcal·mol-1，其中数值越小代表分子与靶蛋白的结合力越好，即分子对于靶蛋白作用力越强。

2 结果

2.1 丹参活性成分的筛选结果通过TCMSP数据库检索共得到丹参中药化学成分202个。将OB≥30%、DL≥0.18作为限制条件后，筛选出有效分子共65个。另通过文献查阅，丹参主要成分有原儿茶醛、丹酚酸B、原儿茶酸、丹参素、咖啡酸、异阿魏酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸C共10种化合物。其中，迷迭香酸与TCMSP获得化合物重合，其余9种化合物作为丹参已经确认成分将其纳入。因此，共得到丹参活性成分74种。

2.2 丹参治疗习惯性流产潜在作用靶点预测结果检索TCMSP及Swiss target prediction数据库初步获取活性成分作用靶点，校正基因名称，剔除非人类靶点及重复靶点，最终预测获得活性成分作用靶点774个(TCMSP来源活性成分作用靶点759个，文献来源活性成分作用靶点15个)。Genecards及OMIM数据库获取习惯性流产靶点，去除重复后获得1 956个习惯性流产相关靶点 (Genecards，1 941 个；OMIM，26个)。将习惯性流产靶点与活性成分靶点映射取交集获得303个交集靶点，该交集靶点极有可能为丹参治疗习惯性流产的潜在作用靶点(图1)。

图1 丹参活性成分靶点与疾病靶点韦恩图

2.3 中药-活性成分-靶点-疾病网络图的构建与分析结果丹参、74个有关活性成分、303个交集靶点以及习惯性流产疾病导入Cytoscape3.6.0构建“中药-活性成分-靶点-疾病网络图”(图2)。该图包含中药、活性成分、靶点、疾病4种不同属性文件，绿色六边形代表丹参，蓝色圆形代表活性成分，粉色箭头代表靶点，粉色三角代表习惯性流产。属性文件中两者间存在联系则通过边表示，同一活性成分发射的边越多代表其作用靶点越多，可通过degree值直观反映其作用靶点数量。degree值排名靠前的活性成分分别为木樨草素(90)、丹参新醌D(63)、紫丹参素C(58)、丹参素(56)，该数据反映单个活性成分可作用于多个靶点。degree值排名靠前的交集靶点为前列腺素内过氧化物酶2(Prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2；58)、乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，ACHE；46)、碳酸酐酶2(Carbonic anhydrase 2，CA2；39)、雄激素受体(Androgen receptor，AR；39)，此数值预示同一个靶点是由多个活性成分共同作用。即丹参治疗习惯性流产具有多成分、多靶点的特点。

图2 丹参活性成分-靶点-疾病网络图

2.4 蛋白质相互作用分析结果丹参治疗习惯性流产的303个交集靶点进行蛋白质相互作用网络分析，其筛选条件为结合打分(combined_score)>0.99。PPI网络图共涉及128个节点和201条边，节点大小直观体现靶点degree值大小(图3)。由图可见细胞肿瘤抗原p53(Cellular tumor antigen p53，TP53；17)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(Cyclin-dependent kinase 1，CDK1；14)、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1；13)、信号传导及转录激活蛋白3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3；12)、周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(Cyclin-dependent kinase inhibitor 1，CDKN1A；11)等在习惯性流产致病过程中与其他多种蛋白相互作用。高degree值蛋白在疾病致病过程中占据重要的地位，即这类蛋白在丹参治疗习惯性流产时起关键作用。综上，PPI网络分析结果表明，该治疗过程具有多靶点协同作用的特点。

图3 丹参-习惯性流产交集蛋白质相互作用网络图

2.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析结果基于DAVID数据库进行潜在靶点的GO功能富集分析，筛选条件为P<0.05。该分析获得1 204个条目(生物过程913条，分子功能191条，细胞组件100条)。首先，细胞组件反映细胞内基因产物(或基因产物组)位于何种细胞器(如质膜、胞浆、核等)，该参数可直接展示丹参治疗习惯性流产过程中行使功能的基因在胞内的主要空间位置。排名靠前的细胞组分主要为质膜、细胞溶质、细胞外间隙、核质等。其次，分子功能主要体现单个基因产物的分子生物学活性(如催化活性、转运活性、结合活性等)。分子功能分析结果为酶结合活性、蛋白质结合活性、ATP结合活性、蛋白激酶活性等。生物过程则是基因(基因组)功能的有序组合，反映了多层次、多步骤的生物学过程。排名靠前的生物过程包括细胞增殖的正调控、炎症反应、蛋白质磷酸化等(图4)。

图4 丹参治疗习惯性流产相关靶点GO功能富集分析

虽然GO富集分析全面体现细胞组件、分子功能及生物过程，但并不涵盖丹参治疗习惯性流产所涉及信号通路及通路中的作用蛋白。故KEGG信号通路富集是揭示丹参治疗习惯性流产相关机制所必不可少的环节。信号通路富集分析得到共138条通路。筛选Count值排名前20条通路进行图片展现。癌症通路、PI3K-Akt信号通路、癌症的蛋白多糖通路、Rap1信号通路、乙型肝炎、癌症中MiRNA、刺激神经组织的交互通路、黏着斑通路、HTLV-1感染信号通路、HIF-1信号通路等(图5)。其中，癌症通路、PI3K-Akt信号通路、癌症中的蛋白多糖通路、Rap1信号通路含有最多的靶点蛋白，分别含有76、51、42、37个靶点。综上，丹参可通过多靶点、多通路治疗习惯性流产。

图5 丹参治疗习惯性流产靶蛋白KEGG通路富集分析图

2.6 分子对接及结合模式分析结果应用LeDock软件将丹参活性成分与关键蛋白对进行分子对接验证，对接结合自由能越低代表结合状态越稳定，本次筛选标准为自由能 ≤ -6 kcal·mol-1。其中，靶点TP53对接效果最好，STAT3次之。丹参中多个活性成分与TP53结合较为稳定，排名靠前的为丹参酚酸C(MOL007137)，黄芩苷(MOL002776)、丹参酚酸 J(MOL007142)、丹参酚酸B(MOL007074)、丹参酚酸A(MOL007136)。而丹参酚酸B、丹参酚酸C、紫草酸(MOL008884)、丹参酚酸 J、丹参酚酸A与STAT3对接效果良好(见表1)。

表1 丹参活性成分与关键靶点的相关信息

分子对接结合模型将展现化学成分与关键靶点间的相互作用情况，直观体现两者结合部位及结合作用力类型(图6)。本文将展现TP53及STAT3结合最稳定的TP53-紫草酸结合模型及STAT3-丹参酚酸B结合模型。其中，TP53-紫草酸结合模型显示，其结合区域为TP53的β-折叠区域形成的疏水口袋，且活性成分与Asp148、Ser220、Thr230形成氢键，与Val147、Leu145形成疏水作用。而丹参酚酸B-STAT3结合模型表明，丹参酚酸B主要以氢键的形式与STAT3的Gly617、Ser613、Ser611、Glu638相互作用，与Pro639、Ser614、Glu612、Ser636通过疏水作用形成稳定构象。

图6 丹参活性成分与习惯性流产关键靶点分子对接模式图

3 讨论

习惯性流产的中医证型以肾虚血瘀为主[11]，治疗原则为补肾化瘀安胎。补肾类中药能够直接作用于卵巢并保持卵巢功能的平衡，使女性内分泌趋于正常，缓解衰老，延长活力，而在补肾的基础上加活血祛瘀中药后，则使卵巢功能得到改善，促进成熟卵泡排卵及黄体发育。《神农本草经》曰：“丹参，味苦微寒，主心腹邪气，肠鸣幽幽如走水，寒热积聚，破癥除瘕，止烦满，益气。一名郄蝉草。生川谷[12]。”现代药理研究证实，丹参可有效防治心脑血管疾病、骨质疏松、妇科疾病、习惯性流产、抗纤维化等[13-14]。虽然临床研究表明，丹参可有效治疗习惯性流产，但相关机制仍需进一步探索。本研究利用网络药理学探寻丹参治疗习惯性流产的活性成分、关键蛋白、基因本体论、相关信号通路，而后利用分子对接技术验证活性成分与关键靶点结合情况。

丹参治疗习惯性流产的主要活性成分为木樨草素、丹参新醌D、紫丹参素C、丹参素。既往研究表明，木樨草素能够有效抑制炎性刺激下中性白细胞、淋巴细胞、成纤维细胞等细胞活化以及NO、白三烯、TNF等炎性物质的释放[15]，抑制前列腺素E2及COX-2蛋白活性进而抑制急性、慢性炎症反应。丹参新醌D可有效抑制人型结核分枝杆菌活性[16]。紫丹参素C作用于血小板活化通路靶点进而干预血栓形成[17]。丹参素作为早期丹参分离出的水溶性代表成分，其临床疗效有抗血栓形成、抗血小板聚集、抑制炎症作用等[18-19]。虽然，丹参主要活性成分治疗习惯性流产的直接研究缺失，但其抗炎作用、抗血栓形成的功能是治疗血瘀型习惯性流产的关键所在。因此，丹参治疗习惯性流产的关键活性成分的获取及分析为今后其药理学研究及实验验证提供了新思路。

丹参活性成分可通过303个蛋白靶点治疗习惯性流产。其中，degree值排名靠前的靶点(PTGS2、ACHE、CA2、AR)可被丹参多种活性成分作用。近期研究表明，自身免疫型习惯性流产小鼠模型中PTGS2亚型(COX-2)的表达明显低于正常妊娠模型[20]。而ACHE在先兆性流产患者体内该酶活性明显低于同时期正常孕妇。故作为孕妇产检指标之一，ACHE的活性检测对预防先兆性流产具有重要意义。血小板CA2功能研究证实其有望成为降低心血管疾病的新靶点[21]。再者，习惯性流产患者体内长的AR基因CAG重复序列会增加复发性自然流产的发病风险[22]。PPI分析显示丹参治疗习惯性流产的关键蛋白为TP53、CDK1、AKT1、STAT3、CDKN1A。此类蛋白可与多种习惯性流产蛋白相互作用，故其在丹参治疗习惯性流产的相关通路中占据重要地位。因此，将关键蛋白与KEGG信号通路结合讨论。

GO富集分析显示，丹参治疗习惯性流产涉及细胞内多空间(质膜、细胞溶质、细胞外间隙等)、多分子生物学活性(酶结合活性、蛋白质结合活性、ATP结合活性等)、多生物过程(细胞增殖的正调控、炎症反应、蛋白质磷酸化等)，即丹参治疗习惯性流产是一个多层次复杂的过程。同时，KEGG分析显示交集靶点富集于癌症通路、PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路等。丹参治疗习惯性流产通过癌症通路中关键蛋白TP53、IL-2、IL-4、IL-6、STAT3等行使功能。其中，习惯性流产患者体内绒毛组织中TP53蛋白表达明显高于健康对照组，调控下游蛋白 CDKN1A、Bax和Bcl-2，介导滋养细胞凋亡，引起其侵袭功能减弱，导致流产[23-24]。IL-2、IL-4、IL-6为细胞因子家族，参与机体免疫反应，母胎界面免疫异常激活是习惯性流产的重要机制。同时，习惯性流产患者母胎界面的Th1/Th2细胞失衡，Th1细胞因子(IL-2、IFN-γ)水平高于健康对照组，Th2细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)含量较低。IL-2抑制滋养层细胞增殖进而抑制胎盘发育，同时促进免疫排斥反应造成胚胎丢失。IL-4 及IL-6的减少导致滋养层细胞入侵功能减退，胎盘血管内皮细胞功能障碍，从而导致流产。同时，细胞因子结合细胞膜受体激活JAK蛋白磷酸化，活化STAT3，调控细胞增殖或凋亡。其中，子宫内膜细胞内STAT3活化降低导致子宫内膜容受性减弱，不易于胚胎着床[25]；ACA阳性流产小鼠母胎界面JAK/STAT3通路蛋白表达异常、滋养细胞迁移异常、子宫内膜细胞生成减少、母胎界面组织受损导致流产[26]。PI3K-Akt信号通路与滋养细胞的增殖、分化与侵袭功能紧密联系。患者子宫蜕膜中PI3K-Akt信号通路关键蛋白表达较正常人明显下调[27]。小鼠实验证实补肾安胎冲剂可通过 PI3K-Akt信号通路改善复发性流产小鼠母胎界面血管生成，稳固妊娠，预防及治疗习惯性流产[28]。Rap1信号通路中EGFR、AKT1、PI3K等为丹参治疗习惯性流产的关键靶点。其中，绒毛及蜕膜组织中 EGFR 的低表达可直接导致流产[29]。综上，丹参通过多靶点、多通路治疗习惯性流产。

丹参活性成分与关键靶点的分子对接结果显示，丹参中水溶性活性成分(丹参酚酸A、丹参酚酸B、丹参酚酸C等)及脂溶性活性成分(黄芩苷、紫草酸)与TP53及STAT3结合度较高。其中，分子对接结果表明，丹参酚酸C与TP53及STAT3的结合能力均较强，该结果验证了丹参治疗习惯性流产具有多靶点的特点。其结合模型3D空间构象结果显示，活性成分通过氢键(与蛋白质的Ser、Thr、Asp等残基形成)及疏水作用结合于TP53或STAT3的蛋白质疏水口袋内。综上，丹参活性成分与关键蛋白的分子对接研究，既验证了网络药理学预测丹参活性成分作用于靶点的可靠性，又反映活性成分与关键蛋白的结合情况。

综上所述，丹参治疗习惯性流产在临床疗效上具有系统性、整体性及协同性，网络药理学分析显示，该过程在机制上具有多组分、多靶点、多通路协同作用的特点。丹参治疗习惯性流产的主要成分为木樨草素、丹参新醌D、紫丹参素C、丹参素等，通过作用关键靶点TP53、CDK1、AKT1、STAT3、CDKN1A治疗习惯性流产。其中，主要涉及癌症通路、PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路等。丹参通过多靶点多通路调控细胞因子的分泌及炎症反应、滋养层细胞的增殖与入侵、子宫内膜容受性、母胎界面血管的生成等生物过程治疗习惯性流产。其中，该研究中活性成分预测的部分靶点功能与已有文献报道高度一致。依托该方法研究丹参治疗习惯性流产的机制具有可靠性、可行性，故该研究结果为后期临床研究及实验验证提供依据。网络药理学及分子对接技术为揭示中药治疗疾病的复杂机制提供切入点，但其深入机制仍需大量的临床研究及基础实验进行科学验证。