核酸扩增技术在食品快检中的应用进展

2022-07-06 17:30杜思
食品安全导刊·中旬刊 2022年6期
关键词:食品

杜思

摘 要:核酸扩增技术是一种扩增特定DNA片段的技术,是基于分子生物技术检测食源性病源体最常用的方法之一。该技术通过检测特定的靶DNA序列来检测食物中的单一细菌病原体,能够将特定靶标放大十亿倍以上,因此在许多应用中发挥了重要作用,包括检测各种病源体和基因克隆。本文就不同核酸扩增技术检测食源性病原菌的原理和应用进行了分类综述。

关键词:核酸扩增技术;快检技术;食品

Application Progress of Nucleic Acid Amplification Technology in Food Rapid Detection

DU Si

(Wuhan Product Quality Supervision and Inspection Institute, Wuhan 430000, China)

Abstract: Nucleic acid amplification is a technique for amplifying specific pieces of DNA, which is one of the most commonly used methods for detecting foodborne pathogens based on molecular biotechnology. It can detect single bacterial pathogens in food by detecting specific target DNA sequences. Because of its ability to amplify specific targets by more than a billion times, it plays an important role in many applications, including the detection of various pathogens and gene clones. In this paper, the principles and applications of different nucleic acid amplification techniques for the detection of foodborne pathogens are reviewed.

Keywords: nucleic acid amplification techniques; rapid detection; food

食源性病源微生物引起的食物中毒事件時有发生,部分商家对肉类成分掺假让消费者蒙受损失。因此,如何提高食品病源性微生物检测、掺假检测和转基因成分检测的速度和效率,是监管部门和食品检验员关心的重点问题。

自DNA分子的双螺旋结构模型被提出,对生物的研究就进入到了分子水平。Kary Mullis提出并发明了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR),使得微量DNA模板在体外大幅增加成为现实。荧光染料和Taq DNA聚合酶的发现使得PCR技术得到了新的发展。为了操作简便,同时提高检测特异性和检测效率,利用不同DNA聚合酶在恒定温度下反应的等温核酸扩增技术被提出,现已有环介导等温扩增反应(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)、滚环扩增(Rolling Circle Amplification,RCA)技术和重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)等多种等温扩增技术被应用于食品检测领域。本文就不同核酸扩增技术在食品检测中的应用进行综述。

1 变温核酸扩增技术

变温核酸扩增技术会经过高温变性、低温退火和适温延伸3个步骤,一般是指PCR技术及其衍生技术。变温核酸扩增技术的出现减短了检测时间,提高了检测灵敏度和检测特异性。通过对一般PCR技术的改进和PCR技术结合其他技术,得到了很多新的检测方法体系,这些检测方法具有检测速度更快,检测精度更高等优点,可区分活死菌和同时检测多种病原菌等。

1.1 实时荧光定量PCR

Applied Biosystems在1996年提出了实时定量PCR,该技术通过使用荧光染料或者荧光探针对PCR产物进行标记跟踪,可实时监控反应过程。不饱和DNA双链染料SYBR Green Ⅰ由C.T.Wittwer报道使用,是目前使用最广的标志性荧光染料。但SYBR Green Ⅰ对PCR反应体系存在一定抑制作用。除了常见的SYBR Green Ⅰ外,邵晓青等[1]发现饱和双链荧光染料LC Green PLUS和EvaGreen,对PCR没有抑制作用且样品间定量均一性和异常复孔出现率均优于SYBR Green Ⅰ。包海燕等[2]使用EvaGreen染料建立基于实时荧光定量PCR的蜡样芽孢杆菌快检技术,对混检的8株蜡样芽孢杆菌全部检出不受干扰,对人工污染的饲料样品增菌18~20 h

后,检测限可达10 CFU/mL。荧光标记探针(TaqMan)是一种双标记的水解探针,5’末端带有荧光基团,3’末端带有猝灭基团,具有高特异性和高灵敏度,且对扩增反应不存在抑制。高正琴[3]建立了TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR检测空肠弯曲菌办法,最低检测限可达4 CFU/mL,且稳定性和重复性良好;应用该方法从78例标本中检出28例,而普通PCR仅检出6例。杨瑶等[4]以猪细胞CACA为目的基因,建立了Taq-Man实时荧光定量PCR检测办法,可准确检测猪DNA含量低至0.1%的DNA样品,猪肉含量低至5.0%(w/w)的肉制品,且相对标准偏差≤25%。魏婉晴等[5]基于实时荧光定量PCR快速检测试剂盒结合叠氮溴化丙锭对活死菌的选择性构建了大肠杆菌O157:H7活菌定量检测技术。结果发现,对菌液稀释检测,最低检测限为84 CFU/mL;将4种常见病原菌基因混检能够准确抗干扰检出大肠杆菌O157:H7;对人工污染样品检测可检测到初始污染量为7.79 CFU/mL。

1.2 微滴数字PCR

微滴PCR被称为第三代PCR技术,其利用油包水乳液体系将一份检测样品分为20 000个纳升级微滴,理论状况下,每个独立的微滴含有一个或不含待检样品目标基因,且每个微滴为一个单独的PCR反应体系。扩增反应完成后,通过对每个微滴的荧光信号进行分析检测,统计学分析和阳性微滴比例以绝对定量的方式直接给出靶基因的个数。微滴PCR各个反应体系在相同的反应条件下平行扩增,消除了PCR反应中不同引物和不同产物之间的相互杂交和竞争抑制;不需要建立标准曲线,不依赖扩增曲线的Ct值,不需要内参基因,具有高通量灵敏度高的优点。赵丽青等[6]针对单核细胞增生李斯特氏菌的hlyA基因建立ddPCR检测方法,检测限可达90 CFU/mL。对人工污染肉制品检测,最低可检出20 CFU/mL单核细胞增生李斯特氏菌。赵新等[7]通過ddPCR技术鉴定转基因大豆‘GE-J12’的外源基因插入拷贝数,结果显示外源目的基因G2-EPSPS和GAT在基因组上的插入拷贝数均值为0.99和1.01,此方法体系检测时间仅需6~8 h,对DNA需求量仅为200 ng。

管锦绣等[8]通过优化RT-ddPCR的退火温度,对稀释后的GⅡ型诺如病毒RNA进行检测,检测灵敏度为5.40 copies/μL,高于RT-qPCR。在对人工污染的西生菜检测中,RT-ddPCR最低检测为54.00 copies/μL,且重复性好。翁文川等[9]通过结合PMA(叠氮溴化丙锭)活细胞荧光染料技术和ddPCR技术,对副溶血性弧菌不同活菌比例的菌液进行检测,发现PMA-ddPCR可在活菌比例大于1%时测定活菌浓度,检测灵敏度为2 CFU/mL;在对人工污染的样品检测时,污染样品基围虾检测灵敏度为1.12×101 CFU/g,污染样品帆立贝检测灵敏度为8.96 CFU/g,均低于PMA-qPCR检测限,在低浓度污染量样品的检测中具有更大优势。

2 等温扩增技术

等温扩增技术反应过程始终维持在恒定温度下,通过添加不同活性的酶和各自特异性引物达到快速扩增核酸的目的。等温扩增技术具有快速、高效、特异性强的优点,同时不需要专用的设备,且操作简单,适用于对检测速度要求高的检测场合,同时对于基础薄弱的基层检测部门具有易普及的优点。常见的等温扩增技术有滚环扩增技术(RCA)、环介导等温核酸扩增(LMAP)、重组聚合酶扩增反应(RPA)以及交叉引物扩增技术(Cross Priming Amplification,CPA)等。相比变温技术PCR,等温扩增技术由于其运用的酶的多样性,各个技术的扩增原理千差万别,不同技术使用的最佳反应温度各不相同。

2.1 环介导等温核酸扩增

环介导等温扩增技术是由Notomi等开发提出,恒定的温度(61~65 ℃)下,在具有高链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)作用下,进行DNA合成反应。LAMP技术针对靶基因上的6个特异性区域设计6对引物:正向内引物、反向内引物和外引物。相比于普通PCR两对引物,特异性极高,且反应温度恒定仅需要一个水浴锅即可完成。在反应进行时,DNA不断合成,生成大量白色的焦磷酸镁沉淀,因此通过肉眼观察白色沉淀是否产生即可判断扩增与否,不需要烦琐的电泳和紫外观察;或者在反应产物中混入荧光染料(SYBR Green Ⅰ),扩增发生则反应体系为绿色,未发生则为橙色。胡仲皓等[10]针对单核细胞增生李斯特氏菌的保守基因actA设计引物,利用荧光染料(SYBR Green Ⅰ)作为反应指示剂,对多种病原菌混检,仅检出单核细胞增生李斯特氏菌,检测下限为4.7×101 CFU/mL。王冠蕾[11]利用PMA抑制死菌DNA扩增的特点,结合PMA和LAMP技术,向反应体系中加入羟基萘酚蓝(HNB)对婴儿配方奶粉中的沙门氏菌活菌进行可视化快检,结果表明对纯培养物稀释检测灵敏度为4.6×101 CFU/mL,对人工污染样品的检测灵敏度为6.3×101 CFU/mL,且检测时间不超过90 min。

2.2 重组酶聚合酶扩增(RPA)

重组酶聚合酶扩增技术在37 ℃下,5~20 min即可完成检测,具有特异性强、灵敏度高、操作简单等优点,甚至可以直接利用人的体温进行检测,适用于现场检测。此技术模仿T4噬菌体内的核酸复制机制,依赖重组酶uvsX和单链结合蛋白Gp32在体外恒温条件下即可实现DNA模板的特异性识别和结合,再通过链置换DNA聚合酶Bsu实现模板DNA的扩增。周树青等[12]利用RPA检测试剂盒建立GⅡ型诺如病毒快速检测体系。对不同诺如病毒、星状病毒、MS2噬菌体、人轮状病毒和人腺病毒基因组混检,结果表明该方法特异性良好且检测下限为106 copies/μL,对人工污染阳性样品进行检测,均可检出且稳定性良好。吴华华等[13]针对金黄色葡萄球菌的nuc基因的保守序列,设计RPA特异性引物,可在37 ℃孵育35 min检测金黄色葡萄球菌,特异性极强,该方法对金黄色葡萄球菌的纯培养物和人工污染样品的最低检出限均为10 CFU/mL。谢实龙等[14]利用RPA技术对转基因大豆MON 89788建立了实时荧光RPA检测体系,该方法绝对检测限可达40拷贝,相对检测限为0.05%,在39 ℃下仅需10 min可完成对实际样品的检测。

3 结语

食品安全问题受到人们的关注,因此对食品安全检测的要求也在不断提高。核酸扩增技术发展日新月异,不同技术具有不同的特点。除了本文提到的核酸扩增技术外,核酸扩增技术和其他技术的结合有以下几种。例如,免疫捕获PCR可适用于病原菌的富集和分离,以减少前增菌的时间进一步缩短检测时间;报告噬菌体法改造噬菌体结合报告基因,改造后的噬菌体侵入细菌释放DNA,检测过程可以区分活死菌。随着分子生物学技术的不断发展,食品快检技术也会随之更新完善,对食品的检测会变得更加快速、便捷和准确。

参考文献

[1]邵晓青,吕申,冯璐,等.三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LCGreen PLUS、EvaGreen在实时定量PCR应用中的比较[J].大连医科大学学报,2016,38(5):428-431.

[2]包海燕,岳喜庆,武俊瑞,等.基于实时荧光PCR技术快速检测饲料中的蜡样芽孢杆菌[J].沈阳农业大学学报,2020,51(3):349-354.

[3]高正琴.空腸弯曲菌TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量PCR快速检测[J].现代检验医学杂志,2019,34(6):1-5.

[4]杨瑶,斯能武,严钰澳,等.实时荧光PCR定量检测肉制品中猪源性成分[J].食品工业科技,2022,43(3):268-274.

[5]魏婉晴,孔梁宇,胡瑞瑞,等.大肠杆菌O157:H7实时荧光定量PCR快速检测试剂盒的组建及活菌检测[J].现代食品科技,2022,38(1):94-103.

[6]赵丽青,方佩佩,唐静,等.数字PCR定量检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌方法的研究[J].食品安全质量检测学报,2017,8(11):4133-4138.

[7]赵新,刘双,刘娜,等.利用微滴数字PCR技术分析转基因大豆‘GE-J12’中外源基因的拷贝数[J].中国农业大学学报,2022,27(1):58-66.

[8]管锦绣,翁文川,许喜林,等.GⅡ型诺如病毒微滴式数字RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J].现代食品科技,2018,34(5):222-228.

[9]翁文川,管锦绣,谢会,等.水产品中副溶血性弧菌PMA-dd PCR活菌定量检测方法的研究[J].现代食品科技,2019,35(6):273-279.

[10]胡仲皓,单兴根,何晓花,等.基于单核细胞增生李斯特菌actA基因的环介导等温扩增技术快速检测方法的建立[J].中国预防兽医学报,2022,44(1):47-52.

[11]王冠蕾.PMA-LAMP法可视化检测乳中沙门氏菌[J].中国乳品工业,2020,48(4):51-54.

[12]周树青,杨栋,金敏,等.重组酶聚合酶扩增技术(RPA)快速检测GⅡ型诺如病毒[J].解放军预防医学杂志,2020,38(1):76-78.

[13]吴华华,王锦鑫,谷庆花,等.金黄色葡萄球菌重组酶聚合酶扩增方法的建立[J].中国预防兽医学报,2020,42(8):797-801.

[14]谢实龙,汪小福,丁晨露,等.转基因大豆MON89788实时荧光重组酶聚合酶扩增检测方法的建立[J].农业生物技术学报,2019,27(7):1301-1310.

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