山西部分地区犊牛腹泻大肠杆菌耐药基因分析

王国艳 范建强 党文庆 何敏 王志宇

摘要 [目的]調查山西省某肉牛场犊牛腹泻源大肠杆菌耐药基因的流行情况。[方法]采用Kirby-Bauer纸片法和PCR法，对分离出的8株腹泻大肠杆菌进行了7种临床常用药物的药物敏感试验及相关耐药基因的检测。[结果]耐3种药物的菌株有1株，耐2种药物的菌株有6株，仅有1株菌对1种药物耐受;分离的8株犊牛源大肠杆菌菌株对四环素、庆大霉素高度耐药，耐药率分别为100%、87.5%;对氧氟沙星、阿米卡星、卡那霉素敏感性较高。分离的8株犊牛源大肠杆菌菌株的 aph3′-Ⅱ、TetD和TetB基因检出率分别为75.0%、62.5%和37.5%。[结论]该肉牛场犊牛源腹泻大肠杆菌存在一定程度的耐药性。

关键词 大肠杆菌;牛腹泻;耐药基因

中图分类号 S 852.61  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）12-0079-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.020

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Drug Resistance Gene Analysis of Escherichia coli from Diarrhea of Calves in Shanxi

WANG Guo-yan1，FAN Jian-qiang2， DANG Wen-qing1 et al

（1.Longcheng Campus， College of Animal Medicine， Shanxi Agricultural University， Taiyuan， Shanxi 030032;2.Loufan Wanshunyuan Agriculture and Animal Husbandry Development Co.，Ltd.，Taiyuan， Shanxi 030300）

Abstract [Objective]In order to investigate the prevalence of drug resistance genes of Escherichia coli from diarrhea in calves of a beef cattle farm in Shanxi Province.[Method]8 strains of E.coli isolated by Kirby Bauer method and PCR were tested for drug sensitivity and related drug resistance genes.[Result]The results showed that 1 strain were resistant to 3 drugs， 6 strain were resistant to 2 drugs， and only 1 strain was resistant to 1 drug.Eight strains of E.coli isolated from calves were highly resistant to tetracycline gentamicin， and the resistance rates were 100%， 87.5%， respectively.The sensitivity to ofloxacin amikacin kanamycin was higher.The detection rates of aph3-Ⅱ、TetD and TetB genes of 8 strains of E.coli isolated from calves were 75.0%， 62.5% and 37.5%， respectively.[Conclusion]The study indicates that there was a certain degree of resistance to E.coli from calf diarrhea in this cattle farm.

Key words Escherichia coli;Cattle diarrhea;Drug resistance genes

犊牛腹泻是一种临床表现以腹泻、脱水、发热、消瘦为主的疾病，没有明显的季节性[1-3]。该病是由病毒、细菌、寄生虫、营养、环境等众多因素引起[4-6]，而由致病性大肠杆菌混合感染引起的占90%[3，7-8]。近几年，山西太原地区肉牛养殖业发展较为迅速，犊牛腹泻越来越引起人们的重视。笔者于2019—2020年在养殖场共采集分离出8株犊牛腹泻大肠杆菌，并进行了耐药表型及耐药基因的检测，旨在为养殖场犊牛大肠杆菌腹泻的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源。

于2019—2020年共采集山西省太原地区某肉牛场分离的8株腹泻大肠杆菌，由山西农业大学龙城校区（原山西省农业科学院畜牧兽医研究所）保存。菌株编号为1～8号。

1.1.2 主要试剂。

水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）培养基、Mueller-Hinton 肉汤（MH肉汤）购自青岛宾得生物技术有限公司;细菌基因组DNA 提取试剂盒、2×Taq MasterMix、marker、琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自天根生化科技（北京） 有限公司;药敏纸片：阿米卡星（10 μg/片）、头孢曲松（30 μg/片）、氧氟沙星（30 μg/片）、诺氟沙星（30 μg/片）、卡那霉素（30 μg/片）、庆大霉素（10 μg/片）、四环素（30 μg/片），购自北京天坛生物制品有限公司。

1.1.3 引物的设计与合成。

參照参考文献[9-11]合成相关引物，包括四环素类耐药基因（TetA、TetB、TetD）、β-内酰胺类耐药基因（SHV）、氨基糖苷类耐药基因[aph3′-Ⅱ、aac（6′）-Ib]，引物信息见表 1。引物由生工生物工程（ 上海） 股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株复苏。

将保存的菌株分别划线接种于MH琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基（MAC）、伊红美蓝琼脂培养基（EMB） ，37  ℃恒温过夜培养;将EMB培养基上生长的单个菌落接种于MH营养肉汤中，37 ℃恒温振荡培养12～16 h。

1.2.2 药敏试验。

参照美国临床实验室标准委员会[12]（NCCLS）推荐的K-B纸片扩散法对复苏的8株菌株进行药物敏感性试验，并根据临床实验室标准化协会[13]（CLSI） 标准判定结果。

1.2.3 大肠杆菌耐药基因的检测。

以大肠杆菌细菌基因组DNA为模板对分离的8株大肠杆菌进行PCR检测。PCR扩增体系（20 μL）：2×Taq Master Mix 10 μL，上、下引物各1 μL，DNA 模板1μL，ddH2O 7 μL，各PCR扩增程序见表2。对PCR产物进行电泳分析。

2 结果与分析

2.1 菌株复苏

8株菌株在MH上呈灰白色;在MAC上呈砖红色或粉红色菌落，在EMB上呈黑绿色金属光泽菌落。

2.2 药敏试验 8株大肠杆菌的药敏试验结果见表3、4。

由表 3、4可知，四环素的耐药率为 100%;对氧氟沙星、阿米卡星、卡那霉素的高敏率为均87.5%;经过对这8株菌株的耐药谱分析发现，耐3种药物的菌株有1株，耐2种药物的菌株有6株，仅有 3号菌株对1种药物耐药，说明该肉牛养殖场腹泻大肠杆菌有严重的多重耐药性。

2.3 耐药基因的PCR检测结果 该研究选取了6种耐药基因，通过PCR方法对8株分离菌株进行耐药基因检测，结果见图1。结果表明，8株菌株分别携带不同的耐药基因，具体结果见表5。由表5可知，氨基糖苷类aph3′-Ⅱ基因的检出率较高，为75.0%;未检测到aac（6′）-Ib基因。四环素类TetD基因的检出率为62.5%;TetB基因的检出率较低，为37.5%;未检测到TetA基因。也未检测到β-内酰胺类SHV基因。

3 小结

随着人们生活水平的不断提高，对牛肉的需求也不断增加，肉牛规模化养殖在不断发展，抗生素被用于预防疾病，提高经济效益的同时，也刺激细菌产生耐药性。细菌耐药性的产生对动物疾病的治疗有很大的影响，对健康养殖危害极大。该研究选取2019—2020年从山西省太原地区某肉牛场分离的8株牛源腹泻大肠杆菌进行敏感药物筛选试验，其中耐3种药物的菌株有1株，耐2种药物的菌株有6株，仅1株菌对1种药物耐受;所有菌株对阿米卡星、卡那霉素、氧氟沙星均高度敏感，可以作为该养殖场的优先选择药物。所有菌株对四环素均耐药，对氨基糖苷类药物庆大霉素的耐药率均为87.5%。李慧等[14]对宁夏地区66株牛源大肠杆菌进行耐药性，检出显示庆大霉素的耐药率为15.15%;高海慧等[15]研究结果表明，宁夏地区164株犊牛腹泻源大肠杆菌对头孢唑啉的耐药率达到95%。这些报道表明，不同地区分离的腹泻大肠杆菌菌株的耐药性不同，山西省太原地区某肉牛养殖场的腹泻大肠杆菌菌株有其耐药表征。

对6种耐药基因检测的结果表明，该养殖场分离的腹泻大肠杆菌携带的耐药基因主要是氨基糖苷类aph3′-Ⅱ基因，检出率为75.0%。四环素类TetD基因，检出率为62.5%;TetB基因的检出率为37.5%。吴同垒等[16]对秦皇岛地区肉牛腹泻大肠杆菌耐药基因的检测结果表明，四环素类TetD基因检出率较低，为33.3%，说明不同地区肉牛腹泻大肠杆菌菌株的耐药基因存在不同。

因此，在预防和治疗犊牛腹泻大肠杆菌病时，要定期进行敏感药物筛选试验，为临床上合理用药提供科学指导，避免长期使用同样的药物，探索新的治疗方法。

参考文献

[1]

荔霞，王胜义，刘永明，等.犊牛腹泻病因及其药物防治研究进展[J].中国畜牧兽医，2010，37（10）：161-165.

[2] 喻华英，周丽婷.致犊牛腹泻埃希氏菌eaeA基因克隆和序列分析[J].西北农业学报，2013，22（4）：1-5.

[3] 罗甜甜，王仲兵，雷宇平，等.山西省北部地区舍饲犊牛大肠杆菌病主要病原的分离和耐药性调查研究[J].中国动物检疫，2012，29（3）：42-44.

[4] VALAT C，FOREST K，AUVRAY F，et al.Assessment of adhesins as an indicator of pathovar-associated virulence factors in bovine Escherichia coli[J].Appl Environ Microbiol，2014，80（23）：7230-7234.

[5] CONSTABLE P D.Antimicrobial use in the treatment of calf  diarrhea[J].J Vet Intern  Me，2004，18（1）：8-17.

[6] 陆承平.兽医微生物学[M].3版.北京：中国农业出版社，2001.

[7]  PIANCIOLA L，D’ASTEK B A，MAZZEO M，et al.Genetic features of human and bovine Escherichia coli O157：H7 strains isolated in Argentina[J].Int J Med Microbiol，2016，306（2）：123-130.

[8] BLOOD D C，HENDERSON J A.Veterinary medicine[M].Baltimore，Maryland：The Williams and Wilkins Company，1960.

[9] SHAHBAZI S，ASADI KARAM M R，HABIBI M，et al.Distribution of extended-spectrum β-lactam，quinolone and carbapenem resistance genes，and genetic diversity among uropathogenic Escherichia coli isolates in Tehran，Iran[J].J Glob Antimicrob Resist，2018，14： 118-125.

[10] 张金宝，马春芳，余婷，等.宁夏地区奶牛乳房炎大肠杆菌毒力基因检测和耐药性分析[J].畜牧兽医学报，2016，47（1）：177-182.

[11] 岳山，刘宇，刘通，等.黑龙江某牛场腹泻犊牛大肠杆菌致病株分离鉴定及耐药性和耐药基因检测[J].黑龙江八一农垦大学学报，2016，28（6）：79-82.

[12] SAIDANI M，MESSADI L，SOUDANI A，et al.Epidemiology，antimicrobial resistance，and extended-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae in clinical bovine mastitis in Tunisia[J].Microb Drug Resist，2018，24（8）：1242-1248.

[13] 刘少昆.京津部分地区犊牛腹泻大肠杆菌分离鉴定及耐药性分析[D].长春：吉林农业大学，2016.

[14] 李慧，张华雷，齐亚银.石河子地区某规模化牛场致犊牛腹泻的病原分析[J].黑龙江畜牧兽医，2018（23）：102-104.

[15] 高海慧，高小斐，馮卫平，等.宁夏地区犊牛腹泻源大肠杆菌的分离鉴定[J].畜牧与兽医，2019，51（11）：114-117.

[16] 吴同垒，李巧玲，张志强，等.2017—2018年秦皇岛地区犊牛源腹泻大肠杆菌耐药性分析[J].黑龙江畜牧兽医，2019（10）：100-104.