嗜碱纤维素分解细菌的筛选•鉴定及酶活分析

张越锋 吕玲玲 张海沈 王开权

摘要 [目的]從新疆某棉浆废水生化处理系统中分离具有纤维素分解能力的耐碱细菌，分析其物种多样性及纤维素分解酶活性，为生物法处理碱性、纤维素含量高的废水提供菌株。[方法]采用4种特异性碱性培养基分离耐碱细菌，采用刚果红染色法对其中纤维素分解菌进行筛选，通过16S rRNA基因序列分析和生理生化试验对纤维素分解细菌进行初步分类鉴定，采用DNS法对其进行酶活测定。[结果]从各类样品中分离出50株耐碱细菌，筛选出12株纤维素分解细菌，其中有7株芽孢杆菌（Bacillus）、2株涅斯捷连科氏菌（Nesterenkonia）、1株耐盐短杆菌（Brevibacterium halotolerans）、1株假单胞菌（Pseudomonas）、1株另类希灭氏菌（Alishewanella），大部分菌株的最适pH为11～12，且具有良好的耐盐性和纤维素分解酶活力。菌株49228和49239分别与Nesterenkonia flava CAAS 251（T）、Pseudomonas indoloxydans IPL-1（T）的最大相似性为97.71%和98.5%，疑似为潜在的新物种。[结论]该结果初步明确了棉浆废水生化处理系统中的碱性细菌为优势种群，嗜碱纤维素分解菌的获得可为生化法处理纤维素含量高的碱性废水处理提供优势菌株。

关键词 棉浆废水;纤维素分解细菌;筛选;鉴定;嗜碱细菌;酶活分析

中图分类号 Q93  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）12-0016-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.004

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening，Identification and Enzymatic Activity Analysis of Alkalophilic Cellulose Decomposing Bacteria

ZHANG Yue-feng1，L Ling-ling1，ZHANG Hai-shen2 et al

（1.College of Agriculture and Food Engineering，Baise University，Baise，Guangxi 533000;2.College of Life Sciences，Tarim University，Alar，Xinjiang 843300）

Abstract [Objective]To isolate alkali-resistant bacteria with cellulose decomposition ability from some samples of a cotton pulp wastewater biochemical treatment system in Xinjiang，and analyze their species diversity and cellulose decomposition enzyme activities，these strains could be used for biological treatment of wastewater with high alkaline and cellulose content.[Method]Four kinds of specific alkaline media were used to isolate alkali-tolerant bacteria，Congo red staining were used to screen the cellulolytic strains，and 16S rRNA gene sequence analysis and physiological and biochemical experiments would be used to identify taxonomy of cellulose-decomposing bacteria，and the cellulase activity of these strains were determined by DNS method.[Result]Fifty strains of alkali-resistant bacteria were isolated from various samples，and 12 strains of cellulolytic bacteria were screened，including 7 strains of Bacillus，2 strains of Nesterenkonia，1 strain of Brevibacterium halotolerans，1 strain of Pseudomonas，1 strain of Alishewanella，the optimum pH of most strains was 11-12，and had good salt tolerance and cellulolysis enzyme activity.Among them，Similarity of 49228 and 49239 to Nesterenkonia flava CAAS 251（T） and Pseudomonas indoloxydans IPL-1（T） was 97.71% and 98.5% respectively，they might be potential new species.[Conclusion]The research showed that alkaline bacteria are the dominant species in the treatment system of cotton pulp wastewater，those alkalophilic cellulose-decomposing bacteria can be used as engineering strains for treatment of alkaline wastewater with high concentration of cellulose.

Key words Cotton pulp wastewater;Cellulose decomposing bacteria;Screening;Identification;Alkophilic bacteria;Enzyme analysis

棉漿黑液是以棉短绒为原料生产棉浆粕过程中产生的高污染的废水，其中含有大量的纤维素、木质素、半纤维素等有机污染物，该废水具有碱性高、色度大、难降解的特点[1]，其如何深度处理已成为人们普遍关注的问题之一。目前，对棉浆黑液的处理主要采用生物法或者以生物法为核心的耦合工艺，如生物活性炭纤维法[2]、超声-生物法[3]和生化-物化组合工艺[4]等。在这些工艺中，微生物的种类及代谢活性高低是决定废水处理效率高低的关键因素，基于棉浆黑液具有碱性高、纤维素含量高的重要特点，从某些特定样品中筛选具有分解纤维素活性的高效嗜碱细菌具有重要价值。有研究表明，棉浆黑液中蕴含着大量嗜碱微生物，如文金丽等[5]以棉浆黑液为细菌分离培养基，从某化纤厂黑液生物处理系统中分离到16株嗜碱细菌，经鉴定这些菌株主要为产芽孢的革兰氏阴性细菌。

嗜碱细菌是一类存在于盐碱土壤或水体等环境中，在高pH或高盐条件下能够稳定生长的一类微生物[6-7]。由于长期的环境选择压力使嗜碱细菌演化形成了特殊的生物结构、生理机能和遗传基因，从而对盐碱环境的胁迫表现出良好的适应性，此外，还可以产生多种碱性酶和其他生物活性物质，是研究生物进化、生命起源和生物多样性的重要材料，也是一类极具应用前景的极端环境微生物资源[8-9]，可广泛应用于洗涤剂工业[10]、纺织[11]、造纸[12]、污水处理[13]等领域。因此该研究从棉浆黑液生物处理系统的水样和泥样中分离嗜碱细菌，然后筛选具有代谢纤维素能力的活性菌株，并进行菌种初步鉴定及酶活性测定分析，以期为嗜碱纤维素分解细菌的挖掘以及在碱性难降解废水处理中的应用提供菌株资源和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品。采集新疆阿拉尔市某棉浆厂的棉浆黑液、生化池水样和生化池泥样。这3类样品的特点是色度高，含有的主要污染物为纤维素、木质素及其水解产物，其中棉浆黑液的碱性最高（pH约为12.0）、纤维素含量最大，生化池水样和泥样的酸碱性接近中性（pH约为6.5）、纤维素较低。样品采集过程均严格按照无菌操作进行。

1.1.2 嗜碱细菌分离培养基。下列培养基为系列pH不同的培养基。①改良培养基一号：棉浆黑液+15%琼脂，pH 12～13，121 ℃灭菌30 min。②改良培养基二号：生化池水样+15%琼脂，pH 12～13，121 ℃灭菌30 min。③马铃薯-蔗糖培养基：马铃薯200.0 g（切块于1 L水中煮沸15 min，过滤的萃取液），蔗糖20.0 g，琼脂15.0 g，定容于1 L容器中，pH 7～13，121 ℃灭菌30 min。④LB固体培养基：酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂粉18.0 g，pH 7～13，121 ℃灭菌30 min。⑤LB液体培养基：酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，pH 7～13，121 ℃灭菌30 min。

1.1.3 纤维素分解细菌筛选培养基。羧甲基纤维素10.0 g，MgSO4 1.0 g，KNO3 1.0 g，K2HPO4 0.3 g，NaCl 0.5 g，酵母粉2.0 g，琼脂 15.0 g，定容于1 L容器中，pH 7～13，121 ℃灭菌30 min。

1.1.4 生理生化试验培养基。酵母提取物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，琼脂粉18.0 g，定容于1 L容器中，根据培养条件调节不同pH和NaCl浓度，121 ℃灭菌30 min。

1.1.5 主要仪器与设备。LXJ264201型离心机（北京医疗仪器修理厂）;LDZX-50KB立式电热压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）;DNP-9162型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）;MycyclerTM Thermod Cycler PCR仪（美国Bio-Rad公司）;HYA恒温摇床（中国科学院武汉仪器厂）;SW-CJ-2F 超净工作台（上海博讯实业有限公司）;LGJ-10C型冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂）。

1.1.6 主要试剂。DNS试剂，采用文献[14]中方法进行配制。CMC缓冲液：称取1.0 g CNC-Na溶于pH=9的缓冲液中（100 mL），沸水浴加热至溶化，冷却，过滤，取滤液50 mL，加pH=7缓冲液10 mL，混匀。刚果红染液：精确称取2.5 g刚果红溶于100 mL烧杯中，定容在250 mL容量瓶。

1.2 方法

1.2.1 嗜碱细菌的筛选分离、纯化及保藏。称取不同的土样10 g，分别放入盛90 mL带有玻璃珠的无菌生理盐水中，在摇床上振荡约3 h。将土壤悬浮液和水样进行梯度稀释，选10-2、10-3和10-4稀释度样品涂布于上述分离培养基平皿，每个平皿接种100 μL，分离培养基pH分别为7、8、9、10、11、12，每个稀释度设3个重复。培养皿于28 °C倒置培养2～5 d后观察菌落生长情况，挑取单菌落至LB固体培养基上纯化。对纯化的细菌进行编号并于30%甘油中-20 °C保藏。

1.2.2 菌株16S rRNA基因测序和序列分析。采用CTAB（cetyltrimethylammonium ammonium bromide）法提取细菌总DNA，16S rRNA基因的PCR扩增和测序引物均为通用保守引物27F和1492R，测序工作由上海生物工程有限责任公司完成。将分离菌株的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比对，确定菌株分类地位。

1.2.3 产纤维素酶细菌的筛选。将供试菌株用点接法接种于加1%羧甲基纤维素钠培养基平板上，37 ℃培养7～10 d，用1%的刚果红染色10 min，菌落周围有透明圈的为阳性，即为可以產生纤维素酶的菌株[15]。

1.2.4 菌株生理生化及形态学观察鉴定。

（1）活化菌株。利用三线法将12株细菌接种在LB固体培养基内，进行培养2～3 d。

（2）菌株对盐浓度的耐受性。制作盐浓度为0、5%、10%、15%、20%、25%的LB液体培养基，分别将12株细菌接种于培养基内，48 h后观察测定吸光度。

（3）菌株对pH的耐受性。制备缓冲溶液pH为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13的LB液体培养基，将12株菌接种在培养基内，48 h后观察测定吸光度。

（4）菌株对温度的耐受性。将12株菌接种于LB液体培养基内，放入温度为10、15、20、25、30、37、40、50 ℃培养箱内进行温度试验，48 h后观察测定吸光度。

（5）菌株形态学观察。将12株于37 ℃下培养48 h后的菌株置于显微镜下，进行形态观察并拍照。

1.2.5 纤维素分解细菌CMC酶活的测定。

1.2.5.1 葡萄糖标准曲线的绘制。取11支10 mL的比色管，0～10号试管分别加入0～1.0 mL葡萄糖标准溶液（1 mg/mL），摇匀后加入2 mL DNS试剂，沸水浴5 min，冷却至室温再用蒸馏水定容至10 mL，摇匀后在波长为520 nm下测定吸光度（以1号比色管中的空白样为对照）。以葡萄糖含量（mg）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。

1.2.5.2 酶活测定方法。将纤维素分解菌接种于50 mL培养基中，于37 ℃摇床培养48 h，在4 ℃、10 000 r/min离心20 min 除去菌体，取上清液作为粗酶液。具体测定方法参照文献[14]。

2 结果与分析

2.1 嗜碱细菌的分离 对棉浆黑液、生化池泥样、生化池水样3种样品中的菌落进行分离、纯化后，共得到50株嗜碱细菌，详细情况见表1。由表1可知，棉浆黑液中共分离到31株嗜碱细菌，占总数的62%;生化池水样中共分离得到13株嗜碱细菌，占总数的26%;生化池泥样中分离得到6株嗜碱细菌，占总数的12%。由此可见，棉浆黑液生物处理系统中含有丰富多样的嗜碱细菌，是嗜碱细菌分离的优良场所，这些嗜碱细菌可作为碱性废水生物处理法的菌种。

上述所分离得到的嗜碱细菌大部分来自棉浆黑液中，这可能是由于细菌长期适应强碱性棉浆黑液的结果。而生化池水样和泥样中尽管微生物种类丰富，但这2种环境均为弱酸性或碱性，故嗜碱细菌较少。

2.2 纤维素分解细菌的筛选

2.2.1 纤维素分解细菌的初筛。利用羧甲基纤维素钠的培养基，对所得到的50株菌株进行纤维素分解能力的初步筛选，详细结果如表2所示。由表2可知，50株细菌中共筛选出12株具有分解纤维素能力的细菌，分别是49011、49082、49208、49209、49210、49228、49232、49239、49243、49252、49261、49267，占菌株总数的24%。由此可见，棉浆黑液生物处理系统中含有丰富的嗜碱纤维素分解细菌。

2.2.2 纤维素分解细菌的复筛。利用羧甲基纤维素钠培养基，对初步筛选的12株具有分解纤维素能力的细菌进行进一步复筛，测定其分解纤维素能力的强弱。以得到的透明圈直径作为参考条件，详细结果见表3，部分纤维素分解能力如图1所示。

由表3可知，纤维素分解细菌的复筛结果与初筛结果是一致的，上述12株细菌均具有良好的分解纤维素能力，其中有10株细菌的透明圈直径超过了20 mm，占总数的83%。其中7株来源于棉浆黑液中，进一步说明棉浆黑液是分离嗜碱纤维素分解细菌的优良场所。

2.2.3 供试菌株测序。将12株具有分解纤维素能力的细菌DNA进行PCR扩增后进行测序，得到测序结果。将菌株测序结果与BLAST数据库已知种进行比对后结果见表4，结果显示其中有7株芽孢杆菌（Bacillus），包括6株耐盐芽孢杆菌（Bacillus halodurans）和1株沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis），共占检测细菌的58%;2株涅斯捷连科氏菌（Nesterenkonia），占检测细菌的17%;1株耐盐短杆菌（Brevibacterium halotolerans）;1株假单胞菌（Pseudomonas）;1株另类希灭氏菌（Alishewanella）。其中菌株49228和49239与已知菌的相似性较低，分别为97.71%和98.50%，为潜在新物种。从棉浆黑液中分离的菌株多以革兰氏阳性杆菌为主，占总数的48%。

2.3 生理生化试验

2.3.1 菌株对pH的耐受性。Horikoshi[16]根据耐受碱的程度不同，将在pH 10～12最适或生长良好，但在pH 6.5左右不能或仅能缓慢生长的称为嗜碱细菌。在pH≥10.0最适生长，且pH低于8.0时不生长的为专性嗜碱细菌;在pH≥10.0最适生长，且在中性环境中也能生长的为兼性嗜碱细菌;能在pH 7～9生长，但在pH≥10.0不能生长为耐碱细菌。

对12株纤维素分解细菌的pH耐受性试验结果（表5）显示，所有菌株都只能在碱性条件下生长，故均为嗜碱细菌，其中49228、49232、49243、49239、49252、49261为专性嗜碱细菌，49011、49082、49208、49210、49267为兼性嗜碱细菌，无耐碱细菌。可见上述所有菌株对碱性环境均表现出较强的偏嗜性和适应性，其中大部分菌株的最适pH在10～12，这些菌株具有耐极端碱的特性。

2.3.2 菌株对温度的耐受性。从表6可以看出，所有菌株都可以在15～37 ℃的环境中生长，都不能在40 ℃以上的环境中生长。可见菌株对环境的依赖性不是很高，在常温下均能够正常生长。可能由于该菌株长期在自然温度中受到驯化，所以室外温度中都能正常生长繁殖。

2.3.3 菌株对盐浓度的耐受性。对12株菌进行盐浓度耐受试验，结果显示（表7），供试菌株均可在0～10%盐浓度条件下正常生长，表现出对氯化钠的良好耐受性，而49208、49209、49210、49228对盐浓度耐受能力更强，可达到20%，按照嗜盐细菌分类划分，其中49208、49209、49210、49228、49243、49261为中等嗜盐细菌。可见这些菌株不仅表现出良好的耐碱性同时还表现出良好的耐盐性，可用于盐碱度均高的环境领域。

2.4 葡萄糖标准曲线 从图2可以看出，葡萄糖标准曲线方程为y=0.7x（R2=0.999），可见葡萄糖浓度在0～1.0 mg/mL与吸光度线性相关性很好。2.5 纤维素酶学特性分析 从菌株纤维素酶活测定结果（表8）可以看出，总体来讲，上述12株菌均具有较高的纤维素酶活力，具有较强的分解纤维素能力，其中49011、49082、49239、49208、49243这5株菌的酶活均在30 U以上，具有重要的应用研究价值。

3 结论与讨论

该研究从棉浆黑液的各个生物处理工段的水样和泥样

中共分离获得了50种嗜碱细菌，从形态等特征结构分析，这些菌株具有良好的物种多样性。其中12株具有明显的纤维素分解能力，占总细菌数的24%，说明棉浆黑液是分离嗜碱纤维素分解细菌的良好场所。对12株纤维素分解细菌的生理生化试验和16S rRNA鉴定结果显示，这些菌以芽孢杆菌为主，同时具有良好的耐盐特性，其中有2株菌与已知菌相似度较低，为潜在新物种，具有一定后续研究价值。12株细菌的纤维素酶活结果显示，这些菌株都可以产生纤维素分解酶，绝大部分都具有较高的酶活力，可见这些菌株可以很好地利用纤维素。该研究结果初步明确了棉浆废水生物处理系统中嗜碱细菌的组成和分布，这些菌株的获得可为盐碱度较高、纤维素含量较高的难处理废水的深度处理提供菌种资源，具有较高的工业应用价值。

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