东北地区狐源大肠杆菌耐药性、整合酶及整合子基因的检测与相关分析

闫 爽，冯 涛，王东阳，李雪惠，薛 原

（东北林业大学 野生动物与自然保护地学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

大肠杆菌（Escherichia coli）是人与动物肠道中的一种常在共栖菌，属于条件致病菌[1]，其在某些致病因素诱导下会使宿主出现腹泻和败血症等症状，同时其还可能会随着感染宿主排泄物进入周围环境而感染其他动物。狐的经济价值较高，毛皮十分珍贵，作为重要的经济动物，狐养殖业在中国得到了广泛的发展，随着东北地区狐养殖规模的扩大，养殖场内出现临床抗生素药物滥用的现象，导致狐源大肠杆菌耐药性逐渐增强。耐药性的产生会导致狐大肠杆菌病的诊断和治疗越发困难[2-3]。随着狐源耐药菌株的不断增加，多种抗生素耐药菌（ARB）会导致狐的严重感染甚至大量死亡，阻碍养狐业的发展。

细菌菌株的耐药性通常具有不同的转移机制，并依赖质粒、转座子、整合子等水平或垂直传播[4]。整合子的共性是含有整合酶基因，并位于整合子的5'保守末端，属于酪氨酸整合酶家族[5]。整合子位于可移动遗传元件如接合性质粒、噬菌体以及转座子中，通过整合酶捕获外源耐药基因并可在上游启动子的控制下调控这些耐药基因的表达[6]，使细菌对抗生素表现出耐药以及多重耐药，并在相同或不同种属细菌间转移进而传播耐药基因，这也是大肠杆菌耐药性传播的重要原因[7]。按照整合子编码整合酶基因的序列差异可将其分为9 类，其中I、II、III 类整合子与细菌的耐药性密切相关[8]，且I 类整合子在临床耐药菌株中占比最高[9]。整合子本身虽然不能转移，但却可以定位于质粒或染色体中，或作为转座子的组成而使耐药基因水平传播[10]。

为了解东北地区狐源大肠杆菌耐药性，本实验采用K-B 药敏纸片法检测2016 年～2020 年从东北地区10 个不同狐养殖场分离的330 株大肠杆菌的耐药性，分别采用PCR 检测I 类、II 类整合酶基因和I类、II 类整合子基因，并分析狐源大肠杆菌的耐药性与整合子之间的相关性，为狐养殖场大肠杆菌病的临床用药及耐药机制的研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌 株大肠杆菌质控菌株（ATCC25922），由中国兽医药品监察所提供；接合试验受体大肠杆菌NK5449 株，购自中国科学院微生物研究所，生化特征为不发酵乳糖，不含质粒，对利福平耐药。330 株狐源大肠杆菌，于2016 年～2020 年分离自东北地区10 个不同的狐养殖场。

1.2 主要试剂共6 类15 种药敏片由杭州天和微生物试剂有限公司提供；质粒小量提取试剂盒、DNA回收试剂盒，购自爱思进生物技术有限责任公司；10×Buffer、dNTP、Taq酶、DL2000 DNA Marker、pMD18-T Vector、大肠杆菌感受态细胞、Gold View 染色剂均购自TaKaRa 公司。

1.3 大肠杆菌的药敏试验及多重耐药性分析采用美国临床和实验室标准协会（CLSI）推荐的Kirby-Bauer 法对330 株狐源大肠杆菌进行6 类15 种药物的药敏性试验，按照药敏纸片扩散的抑菌环直径确定不同菌株的耐药性。

1.4 大肠杆菌I 类、II 类整合酶基因的PCR 扩增按照文献[11, 12] 设计并由吉林库美生物科技有限公司合成大肠杆菌I 类、II 类整合酶基因（intI1和intI2）引物，采用煮沸法提取330 株狐源大肠杆菌基因组DNA 作为模板，采用上述intI1和intI2基因引物进行PCR 扩增，根据PCR 扩增结果分析整合酶基因intI1和intI2与大肠杆菌耐药表型的相关性。

1.5 大肠杆菌I 类、II 类整合子基因的PCR 扩增及序列的分析按照文献[13,14]设计并由吉林库美生物科技有限公司合成大肠杆菌I 类、II 类整合子基因以1.4 获得的330 株狐源大肠杆菌基因组DNA 作为模板，采用上述整合子基因引物，经PCR 扩增大肠杆菌I 类、II 类整合子基因。PCR 产物回收纯化后由吉林库美生物科技有限公司测序，利用DNAStar 软件对测序结果校正、拼接后，与GenBank 中登录的大肠杆菌整合子基因序列比对，分析整合子中基因盒的组成。根据PCR 扩增结果分析I 类、II 类整合子基因与大肠杆菌耐药表型的相关性。

1.6 大肠杆菌整合子耐药质粒接合转移试验及接合子中I 类整合酶和整合子基因的检测将PCR 扩增结果为整合子基因阳性的大肠杆菌作为供体菌，E. coliNK5449 株为受体菌，二者混合培养后均匀涂布在抗性（100 μg/mL 链霉素+100 μg/mL 利福平）MH板上，37 ℃恒温培养24 h，提取MH 板上接合子的质粒DNA，测序后统计接合率。并参照1.4 和1.5，通过PCR 扩增接合子中的整合酶和整合子基因。

2 结果与讨论

2.1 狐源大肠杆菌药敏试验及多重耐药性分析药敏试验结果显示，330 株狐源大肠杆菌对β-内酰胺类药物和四环素类药物耐药性较高，其中对氨苄西林耐药的菌株占87.88%（290/330），对四环素耐药的菌株占93.64%（309/330）；其次是对氨基糖苷类药物和磺胺类药物，其中对卡那霉素耐药的菌株占63.94%（211/330），对复方新诺明耐药的菌株占72.12%（238/330）（图1A）。推测由于 氨苄西林、四环素、卡那霉素、复方新诺明属于常用兽用药物，所以产生了对这些药物的耐药性。对β-内酰胺类药物亚胺培南、氨基糖苷类药物阿米卡星相对敏感，敏感菌株分别占86.97%（287/330）和83.94%（277/330）（图1A），对这两种药物敏感主要是由于其在狐养殖场使用较少所致。狐源大肠杆菌的多重耐药性分析结果显示，87.88%（290/330）的狐源大肠杆菌为多重耐药性，其中耐3 种、4 种、5 种、6 种以上药物的菌株分别占17.27%（57/330）、22.42%（74/330）、24.85%（82/330）、23.24%（77/330）（图1B）。上述结果表明东北地区狐源大肠杆菌对四环素类、氨基糖苷类、β-内酰胺类、磺胺类抗生素高度耐药，且多数狐源大肠杆菌具有多重耐药性。

图1 330株狐源大肠杆菌的药敏试验（A）及多重耐药（B）的统计结果Fig.1 Statistical analysis of drug resistance test(A)and multiple drug resistance(B)of 330 strains Escherichia coli isolated from foxes

张召兴等于2016 年对秦皇岛狐源大肠杆菌药敏试验结果显示，检测的狐源大肠杆菌均对四环素类抗生素高度耐药[15]，与本试验结果相似；朱利霞等于2019 年对河北地区狐肺炎大肠杆菌的研究结果显示[16]，81 株狐源大肠杆菌对磺胺类抗生素复方新诺明（SXT）耐药菌株占63.75%（51/81），与本试验结果相似；高光平等于2019 年对秦皇岛昌黎县的狐源大肠杆菌的药敏试验结果显示，这些大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素和四环素类抗生素的耐药性高于对其他类型的抗菌药物[17]，也与本试验结果相似。

2.2 狐源大肠杆菌I 类、II 类整合酶基因的PCR 扩增结果对330 株狐源大肠杆菌的整合酶基因经PCR 扩增并统计结果显示，I 类整合酶基因intI1和II类整合酶基因intI2的检出率分别为63.64%（210/330）和15.45%（51/330），且共有36 株狐源大肠杆菌同时携带intI1和intI2两种整合酶基因。整合酶基因intI1和intI2与氨基糖苷类和磺胺类耐药基因显著相关，整合酶基因通过捕获上述外源耐药基因，在上游启动子的控制下调控这些耐药基因的表达[6]。因此，其与大肠杆菌对氨基糖苷类和磺胺类抗生素的耐药表型相关[18]。本研究中狐源大肠杆菌对氨基糖苷类抗生素卡那霉素耐药的菌株占62.42%（206/330），对磺胺类抗生素复方新诺明耐药的菌株占72.12%（238/330）。表明狐源大肠杆菌对上述药物的耐药表型主要由这两类整合酶基因介导。

2.3 狐源大肠杆菌I 类、II 类整合子基因的PCR 扩增结果及其携带基因盒的组成方式分析I 类、II 类整合子基因的PCR 检测并统计结果显示，330 株狐源大肠杆菌I 类整合子基因检出率为62.86%（207/330），其中有33.81%（70/207）携带基因盒，其余未携带基因盒；330 株狐源大肠杆菌中未检出II 类整合子基因。70 个携带基因盒的I 类整合子基因测序后与GenBank中登录的大肠杆菌整合子的基因序列比对并分析I 类整合子中基因盒的组成方式，结果显示，共检测出10 种基因盒，分别是dfrA17、aadA5、dfrA27、aadA2、aadA22、dfrA5、dfrA1、aadA1、dfrA12、orfF，且主要以甲氧苄啶和氨基糖苷类药物耐药性的dfrA和aadA类耐药基因为主，分别占51.43%（36/70）与98.57%（69/70）。氨基糖苷类耐药基因家族aadA及甲氧苄啶类耐药基因家族dfr与整合子关系最密切，是整合子介导的最常见的耐药基因型[10]。基因盒有6 种不同的组成方式，分别是：dfrA17-aadA5（8.57%，6/70）、dfrA27-aadA2（1.43%，1/70）、aadA22（48.57%，34/70）、dfrA5（1.43%，1/70）、dfrA1-aadA1（38.57%，27/70）、dfrA12-orfF-aadA2（1.43%，1/70），其片段大小依次为1 664 bp、1 571 bp、1 009 bp、721 bp、1 585 bp 和1 913 bp。在I 类整合子中检测到的 耐 药 基 因aadA1、aadA2、aadA5、aadA22与 氨基糖苷类抗生素的耐药性相关，而dfrA1、dfrA5、dfrA12、dfrA15、dfrA17则与甲氧苄啶类抗生素的耐药性相关[10]。甲氧苄啶属于二氨基嘧啶类药物，常与磺胺类药物一同使用，以达到抗菌增效的效果，所以又称为磺胺增效剂[19]。本研究并未检测狐源大肠杆菌对该类药物的耐药表型[2]，所以，整合子是否会致狐源大肠杆菌对甲氧苄啶类药物耐药并不清楚；orfF为功能未知的开放阅读框，这些耐药基因可以独立存在，也可与其他耐药基因相互结合存在于狐源大肠杆菌中。其中aadA22类型的基因盒所占数量最多，达48.57%（34/70），是本研究中狐源大肠杆菌最主要的基因盒组成方式，与狐源大肠杆菌对氨基糖苷类抗生素卡那霉素（K）的耐药性较强有关，且其与整合酶基因共同介导了大肠杆菌对该类抗生素的耐药表型。挪威肉类和肉类产品大肠杆菌中最流行的基因盒组成方式为dfrA1-aadA1[5]；在中国宁夏地区牛源大肠杆菌中基因盒dfrA17-aadA5的流行最普遍[20]，上述结果均与本试验结果相似。中国华南东江流域地表水中的大肠杆菌中检测出最常见的基因盒是1.9 kb 的dfrA12-orfF-aadA2[21]，本研究中也检测到该基因盒，但并不普遍，表明aadA氨基糖苷类耐药基因盒在东北地区狐源养殖场中可以稳定存在。本研究中的330 株狐源大肠杆菌对β-内酰胺类药物和四环素类药物的耐药性也较高，但本研究并未在整合子的基因盒中检测到该类耐药基因，这主要是由于大肠杆菌耐药机制很复杂，其还存在其他的耐药机制介导狐源大肠杆菌对上述药物的耐药表型。

2.4 狐源大肠杆菌整合子耐药质粒接合试验及接合子I 类整合酶基因和整合子基因的检测结果细菌耐药质粒分为两种，一种是可发生转移的接合性质粒，另一种是不能发生移动的非接合性质粒，研究发现，整合子基因大多位于接合性质粒上，质粒的接合转移是细菌耐药性和耐药基因水平传播的主要方式之一[22]。因此，可以利用接合试验分析330 株狐源耐药大肠杆菌耐药基因的水平传播情况。本研究以70 株携带基因盒的I 类整合子的狐源大肠杆菌为供体菌，E. coliNK5449 株为受体菌进行整合子质粒的接合转移试验，并通过PCR 扩增接合子的整合酶基因和整合子基因。结果显示，23 株供体菌将携带整合子基因的耐药质粒转入受体菌E. coliNK5449中，接合率为32.86%（23/70），其中I 类整合酶基因检出率为34.78%（8/23），I 类整合子基因检出率为43.48%（10/23），表明耐药基因具有水平转移的能力，但并不能将全部的耐药基因转移到受体菌中。

本实验从东北地区10 个狐场分离的330 株大肠杆菌中检测出I 类、II 类整合酶基因及I 类整合子基因，由于大肠杆菌耐药机制的复杂性，大肠杆菌携带的整合酶、整合子基因及其携带的相关基因盒并不能完全解释这些分离菌株的所有耐药表型。整合子—基因盒虽然是大肠杆菌出现多重耐药菌株的重要原因之一，但其还存在其他耐药机制，如转座子或质粒所携带的耐药基因等，这些耐药机制共同导致了细菌的多重耐药性。今后的研究中应加强对东北地区狐养殖场大肠杆菌耐药性及其整合子系统的监测，控制整合子的流行趋势，为临床控制大肠杆菌多重耐药菌株的传播提供参考依据。