胞内劳森氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立及应用

王丹丹，周俊明，倪艳秀，祝昊丹，朱雪蛟，周金柱，李 彬

（江苏省农业科学院兽医研究所，江苏 南京 210014）

猪增生性肠炎（Porcine proliferative enteritis，PPE）又称为猪回肠炎（Porcine ileitis，PI），是由胞内劳森菌（Lawsonia intracellularis，LI）引起的一种细菌接触性传染病[1]。LI 主要感染后备猪和生长期育肥猪，以回肠和结肠的黏膜出现腺瘤样病变为特征，按临床症状分为急性型、慢性型和亚临床型，其中慢性型最常见，主要表现为间歇性下痢、食欲下降和生长缓慢，饲料利用率下降，导致养殖成本增加[2]。该病自1931 年首次报道以来，加拿大、巴西、法国、希腊、泰国、日本、朝鲜、印度、中国等20 多个国家陆续发表LI 感染的相关报道，至今PPE 呈世界范围内流行[3-7]。我国目前对LI 的流行病学调查尚不全面，LI 的流行地区尚不明确，但上海、福建、广东、广西、湖南、湖北等地猪场的检测报告显示，该病阳性检出率最高可达100%[8]。给养猪业造成了极大的经济损失，开展该病诊断方法的研究，对于该病的诊断具有重要意义。

目前，国内外鉴定LI 的实验室方法主要为组织病理学诊断、血清免疫学诊断和分子生物学诊断等。血清免疫学诊断方法主要包括间接荧光抗体试验（Indirect immunofluorescent antibody test，IFAT）、免疫过氧化物酶单层抗体试验（Immunoperoxidase monolayer assay，IPMA）和酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等[9-10]。IFAT 和IPMA 均适用于LI 的活体检测，但这两种方法对操作者的要求较高，结果判定的主观性较强，易产生人为误差。此外，IFAT 检测易出现假阴性，IPMA 检测易出现假阳性。

ELISA 方法可以对大量样品进行检测，并且因快速、操作简便等优势，广泛的用于多种疫病的诊断和检测。研究表明，LI 外膜蛋白LI1022 具有抗原性，可维持LI 细胞外膜的完整性，有助于LI 对猪回肠细胞的吸附，且参与细菌的黏附和侵袭[11]。本研究以LI 外膜蛋白LI1022 为包被抗原，建立检测LI 抗体的间接ELISA 方法，为我国PI 的防控、保障养猪业的健康发展以及提高养殖业的经济效益提供有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 血清样品319 份临床血清样品采集自2019 年1 月～2021 年2 月江苏地区的6 个猪场；指定猪场采集免疫PI 活疫苗（勃林格殷格翰）后二周的血清（10 头份），经PI 抗体检测试剂盒（瑞士Svanova 公司，批号A99787）鉴定为阳性血清，作为实验阳性对照血清；未免疫的健康猪血清（80 头份），经PI 抗体检测试剂盒鉴定为阴性血清，作为实验阴性血清，以上血清样品均由本研究所动物腹泻病防控创新团队保存。兔抗LI 血清购自上海佑隆生物科技有限公司。

1.2 主要试剂重组表达质粒pET-32a（+）（Novagen）由本实验室保存；BL21（DE3）感受态细胞购自TransGen Biotech 公司；猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）阳性血清、猪伪狂犬病病毒（PRV）阳性血清、口蹄疫病毒（FMDV）阳性血清、猪流行性腹泻病毒（PEDV）阳性血清等标准阳性血清均购自武汉科前生物股份有限公司，由本实验室保存；限制性内切酶BamH I 和Hind III、DNA Marker、Protein Marker均购自TaKaRa 公司；HRP 标记的羊抗猪IgG（IgGHRP）和羊抗兔IgG-HRP 购自武汉博士德生物工程有限公司；TMB 底物显色液购自湖州英创生物科技有限公司；96 孔酶标板购自Corning 公司；增强型ECL化学发光检测试剂购自Vazyme公司；His Trap购自Cytiva公司。

1.3LI1022基因的合成及重组表达质粒的构建根据GenBank 登录的LI 外膜蛋白LI1022全基因序列（AM180252.1），由南京钟鼎生物技术有限公司合成该基因并克隆于pET-32a 载体，构建重组表达质粒pET32a-LI1022，测序鉴定正确后转化到BL21（DE3）宿主菌。

1.4 重组蛋白的表达、纯化及鉴定将重组菌pET32-LI1022/BL21（DE3）在含有50 μg/mL 氨苄青霉素抗性LB 中培养至OD600nm达到0.6，加入终浓度为1 mmol/L 的IPTG，37 ℃诱导表达6 h。离心收集菌体，低温超声破碎，分离并收集上清和沉淀，经SDSPAGE检测，确定重组LI1022蛋白（r LI1022）的表达形式。Ni 柱纯化该蛋白，以兔抗LI 多抗血清为一抗（1∶100），羊抗兔IgG-HRP（1∶10 000）为二抗，对纯化的rLI1022 进行western blot 鉴定。

1.5 间接ELISA 方法的建立及反应条件的优化采用方阵滴定法将纯化后浓度为0.3 mg/mL 的rLI1022作为包被抗原，用包被液依次按1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800稀释，100 μL/孔加入酶标板，4 ℃包被过夜。LI 阳性血清和阴性血清分别用样品稀释液依次按1∶25、1∶50、1∶100、1∶200 稀释，组成方阵。酶标仪测定LI 阳性和阴性血清的OD450nm值，以P/N 值（阳性血清OD450nm值/阴性血清OD450nm值）最大的反应条件为最佳工作条件。同时对包被条件（4 ℃过夜、37 ℃作用1 h 后4 ℃过夜、37 ℃作用2 h）、封闭液（5%脱脂乳、2%明胶）、37 ℃封闭时间（1 h、2 h、3 h），血清37 ℃作用时间（30 min、60 min、90 min），羊抗猪IgG-HRP 稀释倍数（1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000）及其37 ℃作用时间（30 min、60 min、90 min），TMB 室温显色时间（10 min、15 min、20 min）等进行优化，加入终止液（50 μL/孔）终止反应。

1.6 阴阳性临界值的确定利用优化后反应条件，对80 份阴性血清样品进行检测，按照以下公式计算S/P 值：S/P 值=（待检血清OD450nm值-阴性对照血清OD450nm值）/（阳性对照血清OD450nm值-阴性对照血清OD450nm值），计算各待检血清S/P 值的平均值及标准方差SD，当待检血清的S/P 值＜+2s时，判定待检血清为阴性；待检血清的S/P 值＞+3s时，判定待检血清为阳性；+2s≤待检血清的S/P 值≤+3s时，判定待检血清为疑似。

1.7 特异性试验采用已建立的间接ELISA 方法分别对PRRSV、PRV、FMDV、PEDV 阳性猪血清、LI阴性血清和LI 阳性血清进行检测，每份血清设置3个重复。根据OD450nm值判定阴阳性，分析该方法的特异性。

1.8 敏感性试验将LI 阳性血清分别按1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200 稀释，每个稀释度设置3 个重复，采用本研究建立的间接ELISA 检测，分析该ELISA 方法的敏感性。

1.9 重复性试验批内重复试验：选取同一批次包被的3 块酶标板，分别在不同时间对随机选取的5份不同抗体水平的LI 血清进行检测，每份血清3 个重复。批间重复试验：利用已建立的间接ELISA 方法，选取3 个不同批次包被的酶标板，同一时间对随机选取的5 份不同抗体水平的LI 血清进行检测，每份血清3 个重复。

根据各反应孔的OD450nm值，计算各血清样品的S/P 值，以及每份血清样品S/P 值的平均值、标准差s和变异系数CV，用于分析重复性试验的效果。

1.10 符合率试验利用已建立的间接ELISA 方法与瑞士Svanova 公司PI 抗体检测试剂盒同时检测54份临床猪血清样品（2019 年1 月～2021 年2 月于江苏地区采集的临床血清），分析检测结果，计算二者的符合率。

1.11 临床样品检测利用本研究建立的间接ELISA方法对江苏部分地区（连云港61 份、徐州64 份、宿迁62 份、淮安88 份、泰州44 份）的319 份临床猪血清样品进行检测，对检测数据进行统计分析，初步了解LI 在江苏地区的感染和流行情况。

2 结 果

2.1 rLI1022 的表达、纯化及western blot 分析重组菌诱导表达后经超声波破碎后的上清与包涵体，经SDS-PAGE 检测，结果显示rLI1022 主要存在于上清中，融合蛋白大小约32 ku，与预期相符（图1A）；通过Ni 柱纯化上清中的蛋白，获得纯化的目的蛋白，western blot 鉴定结果显示，纯化的rLI1022 可与LI 兔多抗发生特异性结合（图1B）。表明纯化后的rLI1022具有较好的反应原性。

图1 rLI1022表达的SDS-PAGE检测（A）及纯化rLI1022的western blot鉴定（B）Fig.1 Analysis of the expressed product of rLI1022 by SDS-PAGE(A)and western blot(B)

2.2 间接ELISA 方法的优化结果通过方阵滴定法，选择阳性血清OD450nm值≥1，阴性血清OD450nm值＜0.2，且P/N 值最大者为最佳条件，优化结果见表1。

表1 间接ELISA检测方法的反应条件优化结果Table 1 The optimized reaction conditions of the indirect ELISA

2.3 阴阳性判定标准的确定利用优化后的间接ELISA 方法检测经瑞士Svanova 公司PI 抗体检测试剂盒检测为阴性的80 份血清。经数据统计，所有血清的S/P 值的平均数=0.114，S/P 值的标准方差s=0.104，+3s=0.426，+2s=0.322。因 此，当待检血清S/P 值＜0.289 时，判定待检血清中LI 抗体为阴性；待检血清S/P 值＞0.426 时，判定待检血清中LI 抗体为阳性；0.322≤待检血清S/P 值≤0.426 时，判定待检血清中LI 抗体为疑似阳性。所有阴性血清样品OD450nm值正态分布结果如图2 所示。

图2 阴性样品结果的正态分布图Fig.2 Negative samples normal distribution diagram

2.4 特异性试验结果利用建立的间接ELISA 方法检测PRRSV、PRV、FMDV、PEDV 阳性猪血清以及LI 阳性和阴性血清，结果显示，除LI 阳性血清为阳性外，其他血清检测结果均为阴性（表2）。表明本研究建立的间接ELISA 方法具有较强的特异性。

表2 特异性试验结果Table 2 Results of the specificity test of the indirect ELISA

2.5 敏感性试验结果利用本研究建立的间接ELISA 方法，对2 倍倍比稀释后（1∶100～1∶51 200）的LI阳性血清进行检测。结果显示，ELISA 方法可检测的血清稀释度为≥1∶400（表3），表明本研究建立的间接ELISA 方法敏感性较好。

表3 敏感性试验结果Table 3 Results of the sensitivity test of the indirect ELISA

2.6 重复性试验结果利用同批包被的ELISA板，于不同时间对随机选取的5 份LI 血清进行检测，结果显示批内变异系数为2.8%～6.0%（表4），表明同一批次的多肽包被的ELISA 板在不同时间检测的重复性良好。

利用不同批次包被的ELISA 板，于同一时间对随机选取的5 份LI 血清进行检测，结果显示，批间变异系数为3.7%～9.4%（表4），表明不同批次rLI1022蛋白作为抗原检测的重复性良好。

表4 重复性试验结果Table 4 Results of the repeatability test for the indirect ELISA

2.7 符合率试验结果利用已建立的间接ELISA 方法与瑞士Svanova 公司PI 抗体检测试剂盒同时检测54份临床猪血清样品，结果显示本研究建立的LI 抗体ELISA 检测方法检测阳性样品29 份，阴性样品25份；瑞士Svanova 公司PI 抗体检测试剂盒检测阳性样品26 份，阴性样品28 份。两者共同检测的阳性血清26 份，阳性符合率100%；共同检测的阴性血清25 份，阴性符合率89.28%；总体符合率为94.44%（表5）。表明该方法与商品化试剂盒符合率高，准确性好。

表5 间接ELISA方法与商品化试剂盒的比较Table 5 Comparison between indirect ELISA method and commercialized ELISA kit

2.8 临床样品检测结果利用本研究建立的LI 抗体ELISA 检测方法检测江苏部分地区319 份临床血清样品，结果显示，总体LI 抗体阳性检出率为87.77%（280/319），其中连云港阳性率为80.33%（49/61），徐州阳性率为89.06%（57/64），宿迁阳性率为85.48%（53/62），淮安阳性率为92.05%（81/88），泰州阳性率为90.91%（41/44）。表明江苏各地区LI 感染率较高。

3 讨 论

PPE 属于慢性消耗性疾病，因其病死率低，一直以来养猪业并未对该病予以足够的重视[12]。近年来，世界各地陆续发表猪场感染LI 的报道，LI 的感染已遍及全世界[13]。我国对该病的研究较为缺乏，对该病防控主要依赖抗生素[14]，随着我国逐步控制、禁止抗生素的使用，这将直接增加防控该病的难度，给养猪业造成经济损失。因此，及时对PPE进行鉴别诊断和监测尤为重要。猪腹泻是养猪业的一类常见病，其病因复杂多样，仅凭临床症状难以区分感染病原，且常伴有混合感染和继发感染。因此明确病原，建立病原鉴别诊断方法尤为重要。目前，对PPE 血清抗体检测的实验方法尚不成熟，尚无PI 抗体检测国家标准，因此本研究中的敏感性试验依据阴阳性血清在预实验中检测的效价进行稀释。国内市场尚无商品化PI 抗体检测试剂盒，国外仅l 款由瑞士Svanova公司生产的商品化PPE检测试剂盒，因此本研究中符合率试验以国外商品化试剂盒作为比对，以确保本研究建立方法的准确性和可行性。

LI 为专性胞内菌，体外分离培养十分困难，近年来PPE 抗原抗体检测技术多以LI 相关蛋白做为研究对象[15-16]。目前，已经公开发表全基因组的LI 有2株，分别是2003 年美国明尼苏达大学发表的PHE/MN1-00（AM180252.1）和2013年英国莫尔登研究所发表的N343（CP004029.1）[17]。PHE/MN1-00编码1 419 个蛋白、N343 编码1 421 个蛋白，但目前大部分蛋白的功能尚不明确。LI1022是LI的外膜蛋白，可维持LI细胞外膜的完整性，有助于LI对猪回肠细胞的吸附，参与细菌的黏附和侵袭，具有一定的抗原性[11,18-19]。实验前期通过生物信息学分析去除LI1022信号肽序列，并利用技术优化其密码子，以提高rLI1022 在大肠杆菌BL21中的表达量。Western blot 结果显示rLI1022 可被兔抗LI 多抗血清所识别，具有良好的反应原性。

将rLI1022 作为包被抗原，经过条件摸索及优化，初步建立了LI 抗体检测的间接ELISA 方法[20-22]。确定了该ELISA 检测方法的阴阳性临界值；与PRRSV、PRV、FMDV、PEDV 等阳性血清均无交叉反应，表明该方法特异性良好；通过组内和组间重复性试验发现，变异系数均小于10%，表明该方法重复性较好。采用该方法与商品化试剂盒共同检测54份临床样品血清，二者总体符合率达到94.44%。对来自江苏部分地区的319 份血清样品进行检测分析，总体阳性率达到87.77%，其中淮安和泰州地区阳性率超过90%，表明LI感染在江苏地区已经十分普遍。

本研究建立了以rLI1022 为抗原检测LI 抗体的间接ELISA 方法，该方法敏感性高、特异性强、重复性良好，与商品化试剂盒对比符合率高，可用于临床血清样品的检测，确认猪群PPE 的感染状态，这对于该病的诊断具有重要意义，为LI 抗体ELISA 检测试剂盒的开发奠定基础，为PPE 流行病学调查及临床诊断提供有效的方法。