基于网络药理学痛泻要方对肠易激综合征和抑郁症异病同治作用机制分析

满姗姗，刘海朝，王 丽，边育红*

（1.天津市第二人民医院药剂科/天津市肝病研究所，天津 300192；2.天津中医药大学中西医结合学院，天津301617）

随着社会的发展，人们生活、工作方式和饮食结构也发生了巨大的改变。肠易激综合征（IBS）是功能性胃肠道疾病中最常见的一种类型，其发生发展由多种因素共同引起。越来越多的证据表明，慢性精神应激是引起IBS发病的主要原因之一。在研究报告中显示，IBS患者常伴有焦虑、抑郁、精神障碍等不同程度的心理异常。慢性反复发作的IBS患者受内外环境刺激所产生的内脏感觉也能通过肠神经系统上行传导至中枢神经系统，影响中枢神经系统的感知、情绪和行为，主要表现为焦虑、抑郁。抑郁症是一种慢性反复发作的精神障碍性疾病，情绪的变化导致患者相关胃肠道神经调节功能发生异常，而这些胃肠症状又会加重患者的焦虑抑郁情绪。IBS和抑郁症共病，严重影响患者的生活质量及工作效率［1-4］。

痛泻要方出自《丹溪心法》，由陈皮、白术、白芍、防风4味中药组成，具有调和肝脾、补脾柔肝、祛湿止泻的功效。现代研究表明，痛泻要方加味能够显著改善抑郁症患者服用SSRI引起的腹泻症状［5-6］，这从理论上解释了可以用异病同治的方法在临床上用痛泻要方治疗IBS和抑郁症。但痛泻要方治疗IBS和抑郁症异病同治的作用机制并不明确，而中药复方又具有多靶点的作用特点，故本研究采用中药网络药理学的方法对痛泻要方治疗IBS和抑郁症异病同治的作用机制进行探讨，为其深入研究及扩大临床应用提供依据。

1 方法

1.1 痛泻要方4味中药化学成分与靶点的获取 首先应用中药系统药理学分析数据库（TCMSP）、BATMAN-TCM数据库检索痛泻要方的4味中药：白术、防风、陈皮、白芍的所有化学成分，并通过文献挖掘进行查漏补缺。根据TCMSP数据库中药物动力学（ADME）参数，设置口服生物利用度（OB）≥30%，同时满足类药性指数（DL）≥0.18等阈值获取所需活性化合物［7-9］。然后将数据库中所筛选化合物的对应靶点进行保存，并将所有靶点全称导入UniProt数据库，物种设置为“human”，获取蛋白靶点的缩略名词，最后将中药、化合物及靶点缩略名词信息导入Cytoscape 3.7.2软件，从而可获得“中药-化合物-靶点”的网络交联信息图，以直观了解痛泻要方4味中药及其化学成分的作用靶点信息。

1.2 痛泻要方异病同治IBS和抑郁症的共有靶点获取 利用GeneCards数据库、OMIM数据库、TTD数据库及CTD数据库，分别搜集IBS和抑郁症的相关疾病靶点，并将痛泻要方作用靶点、IBS相关靶点及抑郁症相关靶点进行取交集处理，所得交集靶点即痛泻要方异病同治IBS和抑郁症的共有靶点，最后将痛泻要方、共有靶点及疾病信息导入Cytoscape 3.7.2软件，从而可获得“痛泻要方-共有靶点-疾病（IBS、抑郁症）”交联信息图，以直观了解痛泻要方异病同治IBS和抑郁症的靶点信息。

1.3 痛泻要方异病同治IBS和抑郁症的关键共有靶点筛选及分析 将痛泻要方、IBS和抑郁症的共有靶点信息导入STRING11.0数据库，设置combined score＞0.4，以获取共有靶点的蛋白质间相互作用关系［10］。将蛋白互作信息导入Cytoscape 3.7.2软件，绘制蛋白互作网络图，并利用Network Analyzer工具进行网络拓扑分析，选取度值大于中位数的靶点作为痛泻要方异病同治IBS和抑郁症的关键共有靶点。

1.4 基因功能与基因通路富集分析 将上述实验获得的关键共有靶点上传至DAVID，参数设置为Homo sapiens，进行GO功能富集分析以及KEGG信号通路富集分析，并对KEGG信号通路富集分析结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 痛泻要方化学成分及靶点的获取 将方中4味中药：白术、防风、陈皮、白芍上传至TCMSP和BATMAN-TCM数据库，按照OB≥30%且DL≥0.18的标准筛选，共得到陈皮5个、白术7个、白芍13个、防风18个活性化合物，删除重复项后共获得40个活性化合物，结果见表1。

表1 痛泻要方中40个活性成分表

2.2 单味药-成分-靶点网络构建 利用Cytoscape 3.7.2软件，导入痛泻要方4个单味药、40个成分和139个靶点的关联信息，得到单味药-成分-靶点网络。如图1所示，共涉及173个节点，454条边。节点表示单味药、成分或者靶点，边表示单味药、成分、靶点彼此之间的关联。其中，圆形节点表示单味药；六边形节点表示化学成分（A1为白芍和防风共有化学成分，A2为白芍、防风和陈皮共有化学成分）；菱形节点表示痛泻要方4味药对应的靶点（139个）。

图1 痛泻要方治疗肠易激综合征和抑郁症单味药-成分-靶点网络

2.3 痛泻要方治疗IBS和抑郁症的共有靶点获取 通过Gene Cards、OMIM、TTD及CTD等数据库搜集IBS、抑郁症相关疾病靶点，去重后获得IBS疾病靶点共3 554个，抑郁症12 610个，将以上2组疾病靶点与痛泻要方139个作用靶点进行取交集，通过Venny2.1进行在线Venn图可视化，结果见图2。可见三者共有靶点有104个，具体如下：XDH、SOD2、MAOA、CDK1、CYP1A1、CHRM1、GSTP1、ADRA1A、LDLR、CCNA2、GSR、CREB1、PGR、CHRM3、SLC6A2、PON1、CHEK1、SELE、MAPK14、PLA2G4A、ACHE、CASP3、NOS3、UGT1A1、FN1、CHRNA2、NR1I3、TNF、PTGS2、ESR1、STAT1、GABRA1、MAPK1、IKBKB、MAPK8、DPEP1、CASP9、CAT、ABCC1、EPHB2、DRD1、SLC6A4、KCNH2、APOB、PPARG、CXCL8、SLPI、ADRB2、ICAM1、MAPK3、CA2、OPRM1、PRKCA、SCN5A、ADIPOQ、NOS2、BCL2、F7、AHR、CYP19A1、GSK3B、MMP1、CDK2、CDKN1A、CHRNA7、PRKCD、MCL1、IL6、CD163、CYP1A2、PIK3CG、RELA、INSR、AKT1、JUN、AR、CYP3A4、PRSS1、CCND1、TGFB1、TIMP1、CD14、HMGCR、NR3C2、HMOX1、GSTM1、TP53、HTR2A、ESR2、CYP1B1、ALOX5、FASN、DPP4、LBP、CASP8、ADRA1B、BAD、CCL2、KDR、PPARA、VCAM1、PTGS1、BAX、MMP9，导入STRING11.0数据库，以combined score＞0.4为筛查标准［9-11］，得出共有靶点的蛋白质间相互作用关系，将筛选后的信息导入Cytoscape 3.7.2绘制蛋白质间相互作用网络图并进行网络拓扑分析，根据度值大于中位数（中位数=21）筛选出关键共有靶点50个，并将关键蛋白互作网络进行可视化，结果见图3。

图2 痛泻要方、肠易激综合征、抑郁症靶点交集Venn图

2.4 GO功能富集和KEGG通路富集分析 将上述获得的关键共有靶点上传至DAVID，参数设置为Homo sapiens，进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集，共获得生物过程（BP）350个，主要涉及对药物的反应（response to drug）、老化（aging）、缺氧反应（response to hypoxia）、脂多糖介导的信号通路（lipopolysaccharide-mediated signaling pathway）、转录正调控、DNA模板（positive regulation of transcription，DNA-templated）、细胞对有机环化合物的反应（cellular response to organic compounds）等；细胞组成（cellular component，CC）39个，主要涉及小窝（caveola）、细胞质（cytosol）、细胞外间隙（extracellular space）、核质（nucleoplasm）、细胞核（nucleus）、线粒体（mitocho ndrion）等；分子功能（molecular function，MF）77个，主要涉及酶结合（enzyme binding）、相同蛋白质结合（i dentical protein binding）、转录因子结合（transcription factor binding）、血红素结合（heme binding）、转录调控区DNA结合（transcription regulatory region DNA binding）等，根据P值大小排名前10的结果见图4。

图4 GO功能富集分析

通过DAVID进行KEGG信号通路富集分析获得92条信号通路，根据P值排序靠前的通路主要涉及TNF、Toll-like receptor、NOD-like receptor、Prolactin、FoxO和PI3K-Akt等信号通路，主要与氧化应激、免疫调控、炎症、凋亡以及内分泌代谢相关，采用Omicshare对前20条KEGG信号通路进行富集分析结果的可视化，结果见图5。

图5 KEGG信号通路富集分析（前20）

3 讨论

中医认为，IBS发病与脾胃运化失常、肝郁气滞、湿热内蕴密切相关；抑郁症更多的被纳入“郁证”，其发病主要与情志不遂、肝气郁结相关。肝气不通则痛，肝失疏泄，必使脾运失健，肠道分清泌浊功能紊乱。所以说肝郁脾虚、肝脾不和为共同病机［12-14］。痛泻要方中的白术苦甘而温，补脾燥湿以治土虚，是为君药；白芍酸寒，醒脾和胃，为臣药；配伍少量防风，具升散之性，与术、芍相伍，辛能散肝郁，香能舒脾气，且有胜湿以助止泻之功，又为脾经引经之药，故兼具佐使之用。四药相合，可以补脾胜湿而止泻，柔肝理气而止痛，使脾健肝和，痛泻自止［15］。卢璐等［16］的研究表明，IBS-D患者普遍存在焦虑、抑郁的心理问题，加味痛泻要方既能明显改善患者的腹痛、腹泻症状，又能有效改善患者的心理状态。赖金枚等［17］的研究表明，加味痛泻要方通过干预脑-肠轴改善IBS-D伴焦虑状态患者的临床症状。因此，本文利用网络药理学方法对痛泻要方异病同治IBS和抑郁症的作用机制进行探讨。

3.1 痛泻要方各组成中药的活性成分 本研究通过网络药理学的方法探讨痛泻要方对IBS和抑郁症异病同治的作用机制，共筛选出40个活性化合物，主要包括柚皮素、芍药苷、白术三醇、苍术内脂、黄芩素、前胡素、欧前胡素、防风色原酮、谷甾醇、5-O-甲基维斯阿米醇等，涉及黄酮类、内酯类、苷类等几大类。实验证明，一方面，芍药苷可通过升高Caco-2细胞中核因子抑制蛋白-κBα（IκBα）的表达，发挥缓解IBS症状的作用；另一方面，芍药苷还能通过抑制CASP-11/GSDMD通路实现抗抑郁的作用［18-19］。欧前胡素可明显改善PS♂子代抑郁样行为，具有抗抑郁作用，其机制可能与升高5-HT浓度及5-HT1AR mRNA的表达，降低5-HTT mRNA的表达有关［20］。

3.2 痛泻要方异病同治关键共有靶点的作用分析 本研究通过网络分析获得共有靶点104个，其中关键共有靶点50个，主要有IL6、AKT1、PTGS2、JUN、TNF、TP53、CASP3、MAPK3、MAPK1、MMP9等。IL6作为关键作用靶点，是一种促炎细胞因子，由单核巨噬细胞、Th2细胞产生，在炎症和B细胞成熟过程中可分泌入血清，介导IL6受体α诱导转录，参与到免疫、炎症的调节。研究证明，IBS患者的白介素水平在其发病机制中发挥着重要的作用，其IL6的水平明显高于对照组；而通常被认为是“致抑郁”的IL6依据其浓度和与其他炎症细胞因子的组合情况，可以发挥促进和抗炎（潜在的抗抑郁）特性［21-22］。肿瘤坏死因子（TNF）中的TNF-α是与免疫相关的重要炎症因子，不仅在炎症免疫方面发挥着重要作用，同时还可调节神经元兴奋性传递、介导神经炎症和神经退行性过程［23-24］。IL6与TNF二者可以发挥协同作用［25］。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一类信号转导蛋白酶，参与细胞生长、有丝分裂、发育、分化和凋亡等相关信号通路，调节炎症反应、应激适应等多种重要的生理病理过程［26-27］。AKT是属于AGC家族的丝氨酸/苏氨酸激酶，AKT1是三种同工酶（AKT1、AKT2、AKT3）之一，这些同工酶具有高度的序列同一性和部分重叠的底物特异性。在功能上，AKT通过磷脂酰肌醇-3激活一系列下游底物的丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化，调节细胞存活、增殖、DNA修复和合成代谢过程［28-31］。前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）又被称为环氧合酶2，是生物体内PG合成的关键酶，在炎症条件下诱导产生，参与内皮细胞增殖、抗凋亡过程。实验证明，IBS-D患者的结肠活检显示PGE2水平升高，其作用机制可能与结肠肥大细胞异常合成PGE2可能诱发IBS-D患者的内脏超敏反应有关；而COX-2/PGE2活性的增强，有效地诱导了抑郁症的核心症状［32-33］。胱天蛋白酶3（CASP3）是半胱氨酸蛋白酶家的主要亚科之一，在细胞凋亡过程中起重要作用［34］。

3.3 痛泻要方异病同治关键靶点的功能富集和通路分析 通过DAVID对关键共有靶点进行GO功能富集和KEGG通路分析发现痛泻要方治疗IBS和抑郁症中的生物过程主要涉及TNF、Toll-like receptor、NOD-like receptor、Prolactin、FoxO和PI3K-AKT等信号通路。TNF信号通路对促进细胞生长、分化、凋亡及诱发炎症均发挥了较强的效应，在炎性肠病中，TNF可诱导上皮细胞凋亡和炎症反应的发生［35-36］。TLR/NLR通路与机体中先天性免疫和炎症密切相关，其中TLR可同时识别细胞外和细胞内刺激，NLR可识别胞浆内刺激。TLRs是介导天然免疫防御体系中重要识别受体之一，在介导机体的炎症反应及相关信号传导中扮演着关键的作用。在TLRs家族中TLR2/4因为与消化系统疾病发生和防御有着密切的关系而被广泛研究，并且有研究表明TLR2/4之间的相互协同作用是介导炎性反应和免疫应答效应的基础；大鼠的抑郁样行为可以通过抑制下游炎性因子释放从而降低模型大鼠海马中TLR/NLR通路相关蛋白表达量改善［37-38］。FoxO转录因子调节各种下游靶基因，包括参与细胞分化、生长、存活，细胞周期，葡萄糖和脂质代谢，应激以及活性氧（ROS）解毒的基因。磷脂酰肌醇3-激酶（P13K）和丝氨酸苏氨酸激酶AKT/PKB（AKT）通路通过磷酸化调节FoxO。AKT介导的FoxO磷酸化通过促进其与14-3-3蛋白及其核出口的相互作用以及通过诱导其通过蛋白酶体降解来抑制FoxO的活性［39-41］。

4 结语

通过上述中药网络药理学的方法预测发现，痛泻要方治疗IBS和抑郁症的可能共有信号通路与氧化应激、免疫调控、炎症、凋亡以及内分泌代谢相关，这与目前研究的IBS、抑郁症的作用机制具有一致性，这表明网络药理学的预测结果具有一定的可靠性和准确性，但是需要进一步的实验验证；该研究为痛泻要方作用机制的进一步研究提供参考，也为临床上的合理用药提供依据。