宫颈微生态对高级别宫颈上皮内瘤变患者锥切术后转归的影响分析

王雪琪，罗世城，马 莹，李 莉，李立安，李亚里，翟青枝，孟元光

1 解放军医学院，北京 100853；2 解放军总医院第一医学中心 妇产科，北京 100853

宫颈癌是世界范围内女性的第四大常见肿瘤，2020年全球约有60.4万例新发病例和34.2万例死亡病例，80%以上发生在发展中国家[1]。高危型人乳头瘤病毒(high risk-human papilloma virus，HR-HPV)的持续感染已明确为宫颈病变甚至癌变的危险因素[2]。大部分HR-HPV感染女性可通过自身免疫能力将其从体内清除，但仍有5% ～10%的感染女性无法自行清除，从而导致持续性HR-HPV感染[3]。宫颈锥切术是高级别宫颈上皮内瘤变(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL)的主要治疗方式之一，但仍有5% ～ 16%的HSIL患者在进行锥切手术后进展为宫颈癌[4-5]。治疗后HR-HPV持续感染是疾病进展的高危因素，但导致持续感染的原因尚未明确。有研究显示，阴道微生态的变化与宫颈 HR-HPV 持续感染及宫颈病变有一定相关性[6-7]。目前国内阴道微生态相关研究主要集中在形态学检测，具有较强的主观性[8]。本研究采用高通量测序，针对16S rRNA V3 + V4区域进行扩增测序，进而更为准确、客观地反映出阴道微生态的构成，比较HSIL患者术后HR-HPV转阴组、HR-HPV阳性组和对照组的宫颈菌群组成和多样性。

对象与方法

1 研究对象 对象概况：经解放军总医院伦理委员会同意(S2018-221-01)，签署知情同意书，入组解放军总医院第一医学中心2020年9月- 2021年9月因HSIL行宫颈锥切手术的患者116例，根据术后3个月复查结果，术后持续感染24例。为避免样本量差异造成偏差，根据年龄及体质量指数进行1∶1∶1配比，纳入术后转阴的患者及同期门诊体检的健康受试者各24例。术后持续感染组和术后转阴组的纳入标准：1)HR-HPV阳性的HSIL患者；2) 3 d内无性生活或阴道灌洗；3) 1周无抗生素或阴道用药；4)无宫颈手术史(锥切、LEEP)；5)采样前1周无异常子宫出血；6) 1周内无性激素使用；7)取材前未行阴道消毒；8)非孕期或哺乳期的育龄女性；9)无急性期的阴道或盆腔炎性疾病。排除标准：1)锥切手术后切缘阳性者；2)锥切病理结果为宫颈癌；3)术后3个月内有性生活但未使用工具避孕；4)恶性肿瘤、免疫性疾病患者。健康组纳入标准除HR-HPV阴性外，余标准同上。

2 样本采集及处理 无菌棉拭子在妇科检查时留取宫颈分泌物，置于-80℃保存。待临床结果回报后进行分组。根据Swab Genomic DNA kit试剂盒(康为世纪)说明书对样本的基因组DNA进行提取。采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，用无菌水稀释样品至1 ng/µL。用341F(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3')和806R(5'-GGACTC NNGGGTATCTAAT-3')引物对V3 + V4可变区进行PCR扩增。根据PCR产物浓度进行等浓度混样，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建库试剂盒(Thermofisher)进行文库构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测合格后，使用Illumina平台进行测序。

3 生物信息学分析 对Illumina NovaSeq 测序得到的原始数据进行拼接、质控、过滤，得到可用于后续分析的有效数据。然后基于有效数据进行OTUs聚类和物种分类分析，得到对应的物种信息和基于物种的菌群丰度分布情况。以97%的一致性将序列聚类成为OTUs，共有3 720个OTUs，其中，能够注释到数据库的OTUs数目为3 240(87.10%)，注释到界水平的比例为87.10%，门水平的比例为62.47%，纲水平的比例为61.94%，目水平的比例为59.09%，科水平的比例为52.28%，属水平的比例为39.70%。然后对OTUs序列与Silva132数据库进行物种注释。根据物种注释情况，进一步计算α多样性与β多样性，并进行组间差异的比较。α多样性是对单个样品中物种多样性的分析，包括Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数。Chao1在生态学中常用来估计物种总数，Shannon、Simpson指数用来评估菌群的多样性，Shannon值越大，多样性越高， Simpson指数值越大，说明群落多样性越低，通过α组间差异分析，初步判断各组间微生物群落结构的组成相似性，根据样本所属生态类别进行分析。

4 统计学分析 采用SPSS25.0软件对数据进行统计分析。本研究数据一般资料为非正态分布的计量资料，以Md(IQR)表示，组间比较采用Kruskal-Wallis检验。使用R Studio，STAMP(v.2.1.3)软件对于数据进行可视化，微生物含量数据组间比较使用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 三组一般资料比较 对各组受试者的年龄及体质量指数(body mass index，BMI)进行正态分布验证，显示为偏态分布，使用Kruskal-Wallis检验受试者基础信息，其差异无统计学意义(P＞0.05，表1)，入组人群具有可比性。

表1 三组受试者一般资料比较[Md(IQR)]Tab. 1 Basic imformation in the three groups (Md[IQR])

2 宫颈菌群分布 对宫颈菌群进行物种分布分析，三组人群宫颈菌群在属水平均以乳杆菌属(Lactobacillus)为优势菌。根据样本在属水平的物种注释及丰度信息，选取丰度前10名的菌属进行聚类并绘制柱状图(图1)。可看到三组宫颈微生物优势菌属存在明显的差异。乳酸杆菌为丰度最高的菌，在三组内均为高丰度。奇异菌属(Atopobium)为丰度第2高的菌，该菌属相对丰度在转阴组中最高。加德纳菌(Gardnerella)为丰度第3高的菌，在阳性组中相对丰度更高。

图1 三组患者宫颈菌群属水平物种分布柱状图Fig.1 Histogram of species distribution at genus level of cervical microflora in the three groups

3 组间聚类分析 根据样本属水平的物种注释及丰度信息，选取前35名的菌进行聚类分析，绘制热图(图2)。其中可看到三组菌群优势菌属存在明显的差异，除了共有的乳酸杆菌外，阳性组以肠球菌为主，转阴组以葡萄球菌、棒状杆菌属为

图2 三组宫颈菌群丰度聚类图Fig.2 Cluster diagram of species abundance of cervical microflora in the three groups

主，对照组则以双歧杆菌属、克雷伯氏菌属为主。

4 α多样性分析 本研究结果显示, Chao1指数P均＞0.05，组间物种总数差异无统计学意义，说明三组物种总数相仿。而阳性组与转阴组对比，Shannon指数差异有统计学意义(P=0.039)，这说明两组的宫颈菌群多样性差异有统计学意义，其中阳性组物种分类总数与群落多样性高于转阴组。在物种分布的均匀程度(即Simpson指数)的比较中，其中健康对照组的宫颈菌群群落均匀度高于转阴组，差异有统计学意义(P=0.037)。而健康对照组与阳性组、转阴组比较，其群落多样性差异无统计学意义(图3)。

图3 三组间宫颈菌群α多样性指数Fig.3 Alpha diversity index of cervical microflora among the three groups

5 β多样性分析 β多样性对不同样本的微生物群落构成进行比较分析，距离矩阵热图显示三组两两对比差异均无统计学意义(图4)。基于LDA将三组做LEfSe分析对比三组差异菌属，评估显著差异菌属的影响力，筛选出LDA＞4的菌属，认为是影响力大的菌属。三组比较，其中转阴组中影响力较大的为棒状杆菌属(图5A)。两两比较中，阳性组与转阴组对比分析检测出4个影响力较大的菌(图5B)，均集中在转阴组，在目、科、属、种水平均为棒状杆菌。阳性组与对照组、转阴组与对照组均未筛选出LDA＞4的差异菌属。

图4 三组间β多样性指数热图Fig.4 Heat map of beta diversity index among the three groups

图5 LDA值分布图Fig.5 Histogram of LDA value distribution

取相对丰度前10的菌群，在门水平做UPGMA聚类分析(图6)，可以看到阳性组与转阴组较为相似，与对照组差异较大，优势菌群均以厚壁菌门(Firmcutes)为主。

图6 三组门水平 Top10菌群UPGMA聚类树Fig.6 UPGMA clustering tree of the top 10 microflora at phylum level among the three groups

6 差异菌种分析 经Meta Stat分析筛选具有差异的物种(图7)，在转阴组与对照组的对比中，单胞菌属(Stenotrophomonas)差异有统计学意义(P＜0.01)、拟杆菌属(Bacteroides)差异有统计学意义(P＜0.05)，且均在对照组中相对丰度较高。在阳性组以及转阴组的对比中，链球菌属(Streptococcus)差异有统计学意义(P＜0.01)，单胞菌属、拟杆菌属、韦荣球菌属(Veillonella)差异有统计学意义(P＜0.05)，以上菌属在阳性组中丰度更高；而在阳性组与对照组对比中，存在差异的菌属较多(P＜0.05)，分别为支原体菌属、漫游球菌属、依格纳季氏菌，且在健康组中相对丰度较高。

图7 三组属水平Meta Stat组间差异分析热图Fig.7 Heatmap based on MetaStat analysis among the three groups at genus level

讨 论

全球大多数女性在其一生中至少感染过一次HR-HPV，80%的感染者在2年内可自然清除。有少部分患者因持续感染发展为宫颈病变、宫颈癌[9]。现有研究已证实，高龄、合并感染、病毒类型、癌基因整合与过度表达、免疫逃逸均为HPV持续感染的危险因素[10]。尽管通过宫颈锥切术的治疗，仍有部分患者持续感染HR-HPV，且发生宫颈癌的概率是健康人群的5倍[5]。近年来多项研究表明，阴道微生态会影响HR-HPV的感染或清除[11]。菌群失调是最常见的一种微生态失衡形式，即阴道内的优势菌属乳酸杆菌大量减少，乳酸产生减少，阴道的pH值上升，阴道对病原菌的抵抗力降低，进而导致了各种阴道炎的发生，同时也为HR-HPV的侵袭和繁殖提供了便利。解放军总医院第一医学中心统计了2019年1月- 2020年5月行锥切术女性3个月后的HR-HPV和TCT结果，HR-HPV转阴率为73.04%[12]，明显高于现有报道的25.8% ～ 73.8%[13]。依据年龄、BMI按1∶1∶1分别配比24例术后转阴者及健康受试者入组。配比虽然不能直接控制混杂因素，但提高了控制混杂因素的效率，一定程度减少偏倚，增加可比性。

本研究α多样性提示三组人群均以乳酸杆菌为优势菌属，与现有文献报道相同[14]。国内有研究检测不同级别宫颈病变女性的阴道微生态，发现随着宫颈病变级别升高，阴道微生态多样性也随之升高[15]。本研究中持续感染组宫颈群落多样性高于转阴组，转阴组宫颈群落多样性高于对照组，提示宫颈微生态紊乱患者锥切术后易于持续感染。进一步分析其原因可能为其他菌群多样性增高，病原体大量繁殖并生长，使阴道菌群失调，导致细菌性阴道病、需氧菌阴道炎等。这些致病菌产生的有害物质如亚硝酸铵等增多，干扰阴道局部免疫系统，使机体抗感染能力下降，增加了各种宫颈疾病的患病率[16]。持续感染组中的另一丰度较高的肠球菌有极强的耐药性[17]。有研究证实肠球菌能产生有害化学物质，破坏DNA，改变一些肠道寄生细菌的生长、分裂方式，甚至还会增强致癌基因的活动，但该菌与HR-HPV持续感染的关系仍需要相关研究证实[18]。转阴组中的葡萄球菌是条件致病菌，可引起机体的免疫反应，并且该菌分泌的凝固素可使感染局限，促进致病菌的清除。双歧杆菌作为HR-HPV阴性人群相对丰度较高的菌属，对人体健康具有生物屏障、营养、抗肿瘤、免疫增强、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能。此外，有研究还发现双歧杆菌可激活机体巨噬细胞的吞噬活性，而有助于抑制肿瘤细胞，同时还可通过诱导肿瘤细胞的凋亡而达到抑制肿瘤生长的作用，被认为是维持宫颈微生态平衡的重要菌群[19]。

β多样性分析中，三组菌群结构比较，差异无统计学意义，可能与锥切后持续感染病例过少有关，也可能与随访时间较短有关[20]。大多数随访区间为6个月、6 ～ 12个月、大于12个月，其中持续感染组有一部分人群尚处于HPV清除阶段，若延长随访时间，转阴率也许会更高，两组的菌群差异会更为明显。本研究为避免术后因性生活带来的干扰因素，根据锥切术后医嘱，选择了术后3个月为复查节点。聚类分析树状图中可以看到，术后持续阳性组与术后转阴组菌群结构较为相似，但与对照组差异较大，提示宫颈微生态在一定程度上受HSIL疾病本身的影响，这与我们前期研究结果相符[21]。聚类分析中，三组门水平上厚壁菌门(Firmcutes)占主导地位，这与既往研究一致[22]。消化链球菌是人体口腔、上呼吸道、肠道和女性生殖道的正常菌群，可引起人体各部组织和器官感染，多见与混合感染[23]。该结果提示造成锥切术后预后差异的因素，可能与炎症反应有关，消化链球菌可能成为新的生物标志物。

综上所述，高级别宫颈上皮内瘤变与宫颈微生态相关，术前宫颈微生态可能是影响术后HRHPV转归的重要因素，但由于本研究样本量较少，仍需要进一步扩大样本量。宫颈菌群分析中，消化链球菌是促进转阴的重要微生物，但其对机体消除HR-HPV的机制仍需大量基础实验进一步研究。在HSIL患者术后应注意纠正阴道微生态平衡，这有利于宫颈癌的防治。