韦氏三联九针对视神经牵拉伤大鼠闪光视觉诱发电位的影响

李诗梦，周 剑，韦企平，王 军，孙 武，王 妍，王 杰，夏燕婷

（1. 北京中医药大学，北京 100029；2. 北京中医药大学东方医院眼科，北京 100078；3. 北京中医药大学东直门医院针灸科，北京 100700）

外伤性视神经病变（traumatic optic neuropathy，TON）被认为是一种临床治疗困难的致盲性眼病。我科韦企平教授是韦氏眼科针灸疗法的继承和发扬者，总结出临床效果显著的韦氏三联九针疗法，能有效提升视神经损伤患者视功能［1⁃4］，然而，韦氏三联九针作用机制尚不明确。本研究应用闪光视觉诱发电位（flash visual evoked potential，FVEP）观察韦氏三联九针对视神经外伤模型大鼠的视神经保护作用，初步揭示韦氏三联九针治疗视神经损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

36 只斯贝福（北京）生物技术有限公司［许可证号：SCXK（京）2019⁃0010］提供的健康成年雄性Wi⁃star 大鼠，SPF 级，体质量（259.11±11.77）g，于北京百奥思科生物医学技术有限公司动物房饲养，所有大鼠在12 h 明（06∶00～17∶59）/12 h 暗（18∶00～05∶59）、温度20～25℃、湿度40%～70%、背景噪声<60 dB 的环境中喂养。纳入标准：直接检眼镜查大鼠眼底视网膜及血管无异常。实验期间对动物的处置已得到动物伦理委员会批准。

1.2 主要仪器与试剂

罗兰电生理动物平台、华佗牌一次性针灸针，规格：0.25 mm×13 mm，生产厂家：苏州医疗用品有限公司，批准文号：苏食药监械（准）字2012 第2270884 号。

1.3 分组及模型制备

我科前期研究［5⁃7］表明横向定量牵拉法造成大鼠TON 模型可控性较强，故采用该法进行造模。大鼠眼底直接检眼镜检查未见异常者，适应性饲养7 d，称重、编号，按随机数字表分为4 组，每组9 只。造模均采用大鼠的右眼，将其中18 只大鼠采用横向定量牵拉法制作TON 模型后随机分为韦氏三联九针组和模型组，各9 只，腹腔注射10% 水合氯醛（10 mL/kg）麻醉，眼球涂卡波姆凝胶。从颞侧剪开大鼠右眼眶上缘皮肤，钝性分离至眶尖将视神经充分暴露，必要时切除眶脂肪保证操作空间。在球后1～2 mm 处，取6⁃0 聚酯缝合线将视神经扎紧。缝线另一端接压力张力计并施加0.30 N 拉力将视神经垂直牵拉，保持20 s。纳入实验者需术眼出现瞳孔扩张、直接对光反射消失、间接对光反射存在、眼底未见出血或血管阻塞、视网膜苍白缺血未达5 min，否则剔除。9 只假手术组的大鼠完成术前检查和常规麻醉后，依照上法分离出部分眶脂肪后暴露视神经，不做牵拉处理。术后将各组大鼠皮肤缝合，涂红霉素眼膏，回笼饲养。另有9只大鼠作为正常对照不处理。

1.4 干预方法

造模成功后次日，韦氏三联九针组开始针刺干预，取韦氏三联九针代表穴：一联：“睛明”、“承泣”；二 联：“丝 竹 空”透“太 阳”；三 联：“风 池”、“太 冲”。其中一联和二联腧穴取患侧，三联腧穴取双侧。一联腧穴不行针，余穴平补平泻。每日针刺一次，留针20 min，治疗14 d。按照《实验针灸学》［8］、《大鼠断层解剖彩色图谱》［9］定位取穴。（1）睛明：上下眼睑与内眼角交界处。刺法：将眼球向外推，向内下方斜刺。（2）承泣：瞳孔直下当眶下缘与眼球之间。刺法：上推眼球，沿眶下缘上方直刺。（3）丝竹空：头侧部，眼外上方眶骨凹陷处。（4）太阳：目外眦后上方颞窝中。刺法：丝竹空向太阳透刺。（5）风池：项部，当两耳后角连线中点与耳后角外1/3 和内2/3 处。刺法：向后下方斜刺0.5～0.8 cm，平补平泻。（6）太冲：后肢足背第1、2 跖骨间凹陷。刺法：直刺1 mm，平补平泻。

所有大鼠于干预后第1、7、14 天采用罗兰电生理动物平台进行FVEP 检查，选取阻抗小于15 kΩ的银针电极。枕骨隆凸上方3 mm 处置记录电极，于双眼连线中点处接参考电极，同侧耳廓处连接地电极。闪烁刺激参数：闪光频率2 Hz，闪烁次数80次，闪烁光亮度10 dB。每只眼连续测量至少3 次，每次间隔10 min。检测1 只眼时，对侧眼用不透光黑布完全遮盖。每只眼记录稳定波形3 次。记录波型的潜伏期和振幅。

1.5 统计学处理

统计分析使用SPSS 20.0 软件。若满足正态性检验和方差齐性检验，则进行方差分析，运用LSD⁃t检验进行多重比较。若不符合正态分布、方差齐性，将应用Kruskal Wallis 进行组间检验，多重比较则选用Bonferroni 秩和检验校正P值。P<0.05 则认为差异有统计学意义。

2 结果

由于大鼠FVEP 图谱中各组重复测量均具有较好的同质性，对N2⁃P2 波的识别度较高，本研究以N2⁃P2 波为中心开展统计分析。参考国际视觉电生理标准，由起始至N2 波出现的时长为N2 波潜伏期值，由起始至P2 波出现的时长为P2 波潜伏期值，由N2 波谷至P2 波峰的起伏差为N2⁃P2 波振幅值，通过以上3 组指标综合评估大鼠视功能情况，结果见表1～3。1、7、14 d 各组代表波形见图1～3。

图1 1 d 各组代表波形Fig 1 Representative waveforms of each group on 1 d

表1 N2 波潜伏期（ms，n=9，±s）Tab 1 Latency of N2 waves（ms，n=9，±s）

表1 N2 波潜伏期（ms，n=9，±s）Tab 1 Latency of N2 waves（ms，n=9，±s）

注：与模型组相比，*P<0.05，#P<0.01;与正常对照组和假手术组相比，▲P<0.01。

14 d 105.53±6.31 111.07±18.22▲92.17±9.17 96.47±14.46 4.148组别韦氏三联九针组模型组假手术组正常对照组F 1 d 96.34±9.17*107.81±7.08▲85.27±4.61 89.65±11.84 9.947 7 d 96.03±12.41#113.76±12.80▲90.08±7.95 87.81±7.90 16.847

表2 P2 波潜伏期（ms，n=9，±s）Tab 2 Latency of P2 waves（ms，n=9，±s）

表2 P2 波潜伏期（ms，n=9，±s）Tab 2 Latency of P2 waves（ms，n=9，±s）

注：与模型组相比，*P<0.05，#P<0.01;与正常对照组和假手术组相比，▲P<0.01。

组别韦氏三联九针组模型组1 d 115.12±7.43*140.38±10.65▲7 d 133.48±16.09 141.22±8.58▲14 d 123.67±7.12#139.97±10.26▲113.03±11.01 116.83±17.07 7.388假手术组正常对照组F 107.82±13.13 111.65±12.18 16.353 111.77±12.01 110.29±11.52 20.270

表3 N2⁃P2 波振幅（μV，n=9，±s）Tab 3 Amplitude of N2⁃P2 waves（μV，n=9，±s）

表3 N2⁃P2 波振幅（μV，n=9，±s）Tab 3 Amplitude of N2⁃P2 waves（μV，n=9，±s）

注：与模型组相比，*P<0.05。与正常对照组和假手术组相比，#P<0.01，▲P<0.05。

14 d 8.18±4.16*4.26±1.38▲8.59±2.52 7.00±4.03 2.733组别韦氏三联九针组模型组假手术组正常对照组F 1 d 8.08±3.73 8.40±7.07 9.51±7.79 7.65±5.30 7.972 7 d 7.97±2.73*4.83±1.08#10.22±3.61 9.16±3.05 6.483

图2 7 d 各组代表波形Fig 2 Representative waveforms of each group on 7 d

图3 14 d 各组代表波形Fig 3 Representative waveforms of each group on 14 d

2.1 模型组、假手术组与正常对照组比较

与正常对照组相比，假手术组在1、7、14 d 时，N2 波 峰 潜 伏 期、P2 波 峰 潜 伏 期 和N2⁃P2 波 振 幅 差异均无统计学意义（P>0.05）。而模型组与正常对照组及假手术组相比，1 d 时模型组N2 波峰潜伏期、P2 波峰潜伏期均较假手术组和正常对照组延长（P<0.01），P2 振波幅无统计学差异（P>0.05）。7 d 和14 d 时，模型组N2 波峰潜伏期、P2 波峰潜伏期均较假手术组和正常对照组延长（P<0.01），N2⁃P2 波振幅均较假手术组和正常对照组降低（P<0.05）。见表1～3。

2.2 韦氏三联九针组与模型组比较

与模型组相比，1 d 时韦氏三联九针组N2 波潜伏期、P2 波潜伏期均缩短（P<0.05），N2⁃P2 波振幅差异无统计学意义（P>0.05）。7 d 时，韦氏三联九针组N2 波潜伏期较模型组缩短（P<0.01），N2⁃P2波振幅较模型组提高（P<0.05），此时P2 波潜伏期虽然也有缩减趋势，差异无统计学意义（P>0.05）。14 d 时，韦氏三联九针组P2 波潜伏期较模型组缩短（P<0.05），N2⁃P2 波振幅较模型组提高（P<0.05），此时N2 波潜伏期虽然也有缩减趋势，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1～3。

2.3 组内比较

假手术组1、7、14 d 的N2 波潜伏期、P2 波潜伏期与N2⁃P2 波振幅差异均无统计学意义（P>0.05）。模型组振幅一直在降低，在14 d 与1 d 比较差异有统计学意义（P<0.05）。模型组的N2 波潜伏期与P2 波潜伏期延迟的情况在1～14 d 一直未得到改善（P>0.05）。而韦氏三联九针组N2 波潜伏期延迟在7～14 d 才出现明显差异（P<0.05）；其P2 波峰虽然在1～7 d 明显延迟（P<0.05），但到了14 d 其P2波峰延迟有所恢复，达到与1 d 和7 d 的水平（P>0.05）。韦氏三联九针组N2⁃P2 波振幅在1～14 d 期间亦无明显降低（P>0.05）。

3 讨论

TON 临床表现包括视功能障碍、眼底病变和相对性传入性瞳孔阻滞等，由于直接或间接暴力作用于眼或颅眶区，造成视神经损伤。患者视力在损伤出现后或可急剧减退至指数、光感甚至无光感。TON 已成为国内重要的致盲眼病［10］。临床多使用大剂量甲强龙冲击的经验式治疗，或者联合视神经管减压。但近年的多个研究表明无论单用或联合手术均不能明显改善TON 的预后［11，12］，多数重病患者预后不佳。

中医认为TON 所属“撞击暴盲”的范畴。撞击直损目系之脉络，不能统摄血液，血溢络外，造成血瘀，抑或撞击损伤眼之真气，造成目系之脉络不畅，气血郁滞其中，皆可引起目系失于滋养，终致萎废不用。故脉络受损，气血郁滞为主要病机。针刺治疗本病的理论基础诚如《灵枢•口问》所云“目者，宗脉之所聚也”，眼视物辨色的生理功能需靠脏腑之气血荣养，而这一作用的发挥离不开经络贯通并不断运输气血。有研究表明针刺干预非动脉炎性前部缺血性视神经病变兔眼模型疗效确切，尤其是眶内联合眶外取穴［13］。

“韦氏三联九针”是燕京韦氏眼科临床实践与学术传承中的瑰宝，其针灸处方将深刺近眼三针作为第一联，将透刺眼周腧穴作为第二联，将辨证论治、全身取穴作为第三联。本课题组既往临床研究显示，韦氏三联九针疗法可治疗视神经萎缩患者，包括外伤性视神经萎缩患者，可提升视力，改善视野情况［1⁃4］，并且促使图形视觉诱发电位（pattern vi⁃sual evoked potential，PVEP）出现易化效应，缩减P100 波 潜伏期［14，15］。本研究旨在探 讨韦氏三联九针治疗TON 的作用机制。

横向定量牵拉法能够将视神经直观暴露后开展定量损伤操作，其产生的视神经机械损伤和局部组织缺血与临床中TON 引起的病理变化相似，用于本实验造模较为理想［5］。前期研究显示，将大鼠视神经以0.1 N 垂直牵拉20 s，即可建立视网膜神经节细胞部分丧失的TON 模型［6，7］。

及时了解视功能变化在视神经损伤后指导治疗和判断预后方面至关重要，然而多方面因素均能对主观视功能指标产生影响，并且常存在伴随颅脑外伤引起昏迷的TON 患者。因此，在无法开展主观视功能检查时，客观而敏感的视觉电生理指标极具价值，在动物实验中更是如此。FVEP 作为评价视神经损伤的重要方法，可以通过观察其波幅的降低趋势和波峰的潜伏期来评价从视网膜到视皮层之间视路的功能。FVEP 的波形中P2 波最稳定，且相当于临床中PVEP 的P100 波，能反映TON 大鼠视觉功能障碍水平［16］，被广泛应用于视神经保护的基 础 及 临 床 研 究 中［17⁃19］，故 本 实 验 统 计 分 析 围 绕N2⁃P2 波进行。

本研究以横向定量牵拉法造模，观察韦氏三联九针对视神经损伤大鼠FVEP 的影响。研究结果显示，模型组大鼠造模眼在0.3 N 垂直牵拉20 s 后，24 h 内的FVEP 波形与正常对照组相比有明显的变化。在所有时间点上，模型组和正常对照组在波幅和峰值潜伏期上都有明显的差异。既往研究证实，视神经传导能力下降FVEP 可表现出潜伏期延迟；其轴索数量下降可呈现为FVEP 振幅下降。

本实验一联深刺，取穴睛明配合承泣泄热明目，祛风通络。第二联腧穴应用横透刺法，刺激面积较广，因而刺激量较大，临床中有助于增强行气活血之疗效，更可减少针刺破皮次数，减轻患者刺痛感。取眼周手少阳经之丝竹空透经外奇穴之太阳，以期将旺盛之足阳经气血导入经外奇穴。第三联腧穴选用风池疏风解表、清利头目；配合太冲，其为“四关穴”之一，具有行气活血，疏通经络的功效，并且是肝之原穴，肝开窃于目，可疏调肝之原气上达于目［20］。韦氏三联九针疗法通经脉，调气血，疏壅蔽，营逆顺出入之会，流畅气血精津出入之路，方奏改善视神经机能之功，保护视功能。在本研究中，建立实验大鼠TON 模型次日予以韦氏三联九针治疗，可显著延缓视神经损伤。我们发现，韦氏三联九针组N2⁃P2 波振幅比模型组振幅下降得更平缓，其N2 和P2 波峰潜伏期较模型组缩减。同时，韦氏三联九针组P2 波峰潜伏期在7～14 d 有所改善，而模型组的结果则完全相反，说明模型组的视神经损伤是不可逆转的。

本研究采用横向定向牵拉法造成大鼠TON 模型后，次日可见模型组FVEP 电生理信号N2⁃P2 波幅和N2、P2 波峰潜伏期异常，提示视神经功能下降。此时，予以韦氏三联九针治疗，相较于未予干预而视觉电生理信号持续恶化的模型组而言，有助于改善TON 大鼠视神经部分损伤后FVEP 电生理信号N2⁃P2 波振幅降低的情况，缩减其N2、P2 波峰延迟，延缓病情的进展。因此可以认为韦氏三联九针对视神经损伤的修复有一定的积极作用，可一定程度地恢复视神经功能。本研究从功能学的角度论证了横向定量牵拉法建立大鼠TON 模型的可行性，证明了韦氏三联九针治疗TON 有明显的疗效，可能与其具有改善视神经传导功能、保护尚未变性坏死的RGCs 作用有关，为临床治疗TON 提供了新的思路。

作者贡献度说明：

李诗梦、王军、孙武、王妍、王杰：参与动物实验，指标检测，撰写论文；周剑、韦企平：实验指导；夏燕婷：论文指导，项目负责人。

所有作者声明无利益冲突。