宣痹通络颗粒中丹皮酚含量测定

邵广晴

(万博科技职业学院，安徽 合肥 230031)

0 引言

宣痹通络颗粒主要是由徐长卿、羌活、 独活、当归、川芎、乳香(制)、没药(制)等十二味中药材，经过提取、加工等一系列工序而制成的中药颗粒剂，用于活血通络，散寒除湿，消肿止痛等。方中徐长卿性辛，温，归肝、胃经；其根茎呈不规则柱状，有盘节，断面中空；表面淡黄白色至淡棕黄色或棕色，具有微细的纵皱纹，并有纤细的须根；质脆，易折断，断面粉性，皮部类白色或黄白色；气香，味微辛凉，具有祛风止痒，利水消肿，活血止痛等功效[1]，用于风湿痹痛，胃痛胀满，牙痛，腰痛，跌扑伤痛，在《神农本草经》中被列为上品。现代药理研究表明[2]，徐长卿内含丹皮酚、黄酮苷、多糖类、挥发油及少量的生物碱和维生素等多种成分，具有镇静、镇痛、抑菌、抗炎等多种药理作用[3-4]。因此，对宣痹通络颗粒中有效成分丹皮酚的含量测定方法进行研究。丹皮酚(C9H10O3)，化学名2＇-羟基-4＇-甲氧基苯乙酮，有特异臭，味微辣，在甲醇或乙醇中易溶，在水中不溶。中国药典2020版记载徐长卿的含量测定方法为高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-水(45∶55)为流动相，理论塔板数按丹皮酚峰计不低于3 000[5]。在实验中，同样采取高效液相色谱法，并以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent Eclipse XDB-C184.6×250 mm,5 μm)。为了取得较好的实验结果，调整流动相为乙腈-水（35∶65），检测波长274 nm，理论塔板数不低于5 000为条件，进行丹皮酚含量测定。并验证此法用于宣痹通络颗粒中丹皮酚含量测定是否准确可靠。结果表明，本方法操作简便，重复性好，准确度高。

1 试验药品及主要仪器

1.1 仪器

LC-10AT高效液相色谱仪，SPD-10A 紫外检测器，LC solution色谱工作站，ADVENTURER (AR1140)电子天平(1/10 000)；METTLER TOLEDO(AB135S)电子天平(1/100 000)。

1.2 试药

宣痹通络颗粒样品：由安徽九方药物研究院有限公司提供，批号：20210812，20210814，20210816。丹皮酚对照品：110708-201908，中国药品生物制品检定所。实验中所使用的其他试剂均是色谱纯或分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件

采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent Eclipse XDB-C184.6×250 mm,5 μm)；乙腈-水(35∶65)为流动相；流速为 1.0 mL/min；检测波长 274 nm；柱温 25 ℃；进样体积为 10 μL。按丹皮酚峰计算，理论塔板数不低于5 000。

2.2 样品溶液的制备和测定

2.2.1 对照品溶液制备

取丹皮酚对照品7.29 mg，精密称定，放置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解后精密量取1 mL溶液，放置于10 mL 量瓶中，再次用甲醇稀释至刻度，摇匀，最后用0.45 μm的微孔滤膜过滤，即得。

2.2.2 供试品溶液制备

取宣痹通络颗粒约2.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中。精密量取 25 mL 80%乙醇溶液加入瓶中，称定重量。加热回流30 min，放冷后再次称定重量。两次称定减失的重量用80%乙醇补足，摇匀后滤过。精密量取1 mL续滤液放置于5 mL的量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀后过滤，即得。

2.2.3 阴性样品试验

根据上述供试品溶液的制备方法，用以制备不含徐长卿成分的阴性样品溶液，并根据上述色谱条件进行测定分析。

在对照品对应位置无明显其他峰的出现。结果表明：阴性样品对丹皮酚的测定无干扰。

2.2.4 含量测定方法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，测定并记录色谱图。根据外标法按峰面积计算，即得。

3 结果

3.1 系统适用性试验

取丹皮酚对照品溶液，注入液相色谱仪中，连续进样5次，记录每次峰面积、保留时间、拖尾因子、理论板数。通过分析和计算，丹皮酚对照品溶液连续进样5次，得到的平均保留时间为25.324 min，RSD=0.34%。

平均峰面积为2 167 708，其峰面积(S)测量值相对标准偏差RSD为0.11%(不大于2.0%)，分离度R=2.349＞1.5。平均理论板数为12 746.167，RSD=0.92%。

平均拖尾因子为1.077，RSD=0.36%。结果表明：本法的系统适用性良好，并将理论板数定为不少于5 000为宜。

3.2 线性关系

精密量取适量的丹皮酚对照品浓配液，加入甲醇，分别稀释2倍、5倍、10倍、25倍、50倍，摇匀后作为供试品溶液。分别吸取10 μL上述各稀释倍数的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定并记录峰面积[6]。

用对照品峰面积(Y)回归丹皮酚对照品浓度(X)，得 回归 方 程：Y=101 942X+23 912，相 关 系数r=1(n=5)，丹皮酚对照品标准曲线如图1所示。

图1 丹皮酚对照品标准曲线

结果表明：丹皮酚对照品在所试浓度4.208～ 105.200 μg/mL范围内呈现良好的线性关系。

3.3 精密度试验考察

3.3.1 重复性试验

按照上述含量测定方法项下的测定方法，对同一批次宣痹通络颗粒样品(20210812批)，分别测定6次，记录色谱图，计算含量(mg/g)、SD(%)及RSD(%)[7]。 通过计算得：6次含量测定的结果分别为：1.08、 1.08、1.09、1.09、1.08、1.08 mg/g，X=1.08 mg/g，SD=0.01%，RSD=0.59%。结果表明：该法重复性良好。

3.3.2 中间精密度试验

对同一批次宣痹通络颗粒样品(20210812批)由两人在不同时间、不同仪器上分别进行6次含量测定，两人测得含量(mg/g)数据结果如表1所示。

表1 中间精密度试验结果 单位：mg/g

通过数据分析，第一人对20210812批次宣痹通络颗粒样品进行的6次含量测定的平均含量为1.08 mg/g，SD=0.01%，RSD=0.59%。第二人对同批次宣痹通络颗粒样品进行的6次含量测定的平均含量为1.07 mg/g，SD=0.01%，RSD=0.77%。结果表明：本法具有良好的中间精密度。

3.3.3 溶液稳定性试验

分别取对照品溶液与供试品溶液在0、2、4、6、8、10 h进行进样，测定，记录峰面积并计算RSD(%)值[8]，结果如表2和表3所示。

表2 对照品溶液稳定性试验

表3 供试品溶液稳定性试验

结果表明：在所试10 h内样品溶液的稳定性良好。

3.3.4 准确度试验

称取 1 g同一批号(20210812批)样品(含量为1.08 mg/g)，精密称定后放置于具塞锥形瓶中，加入适量丹皮酚对照品，精密加入25 mL 80%乙醇溶液，称定重量。加热回流30 min，放冷后再次称定重量。两次称重减失的重量用80%乙醇溶液补足，摇匀后滤过。量取续滤液1 mL放置于5 mL量瓶中，用流动相溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。取6份供试品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，测定并记录色谱图[9]， 以峰面积计算本法的回收率。经计算6份供试品溶液的回收率分别为：99.21%、100.17%、99.91%、98.52%、99.01%、99.49%，

平均回收率为99.39%，RSD为0.61%。结果表明：该法对丹皮酚的测定具有良好的准确度。

3.3.5 三批样品的测定

根据上述确定的色谱条件及测定方法，测定三批宣痹通络颗粒(20210812批、20210814批、20210816批)中丹皮酚的含量[10]，结果如表4所示。

表4 三批样品的含量测定结果

结果表明：三批宣痹通络颗粒样品中丹皮酚含量均在1.05～1.13 mg/g之间，结合徐长卿药材丹皮酚含量及其转移率，暂定含量限度为：每1 g宣痹通络颗粒中徐长卿以丹皮酚(C9H10O3)计，不得少于0.80 mg。

4 结语

(1)在《中国药典》2020版三部通则中高效液相色谱法项下记载，流动相常用甲醇-水系统或乙腈-水系统。试验分析中，将宣痹通络颗粒样品分别在不同比例的甲醇-水和乙腈-水为流动相的色谱仪中进行分析比较，发现宣痹通络颗粒样品在甲醇和乙腈中均具有较好的溶解性能，但使用乙腈-水为流动相时，色谱仪记录的色谱峰有较好的峰形，峰宽也较窄，有利于提高柱效。另外采用紫外检测仪进行波长检测时，乙腈-水系统效果更佳。综合各方面的考虑，在宣痹通络颗粒样品丹皮酚含量试验中我们确定使用乙腈-水(35：65)为流动相进行丹皮酚含量测定。

(2)研究中采用SPD-10A紫外检测器对丹皮酚在190～400 nm波长范围测定丹皮酚在不同波长处的吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图，结果显示在274 nm处丹皮酚对照品溶液有最大吸收，因此选择紫外检测器检测波长为274 nm。

(3)温度会影响高效液相色谱仪的分离效果，在温度选择时，综合考虑色谱仪的分离效果和实验室试验的实际情况，选定在室温25 ℃进行宣痹通络颗粒样品中丹皮酚的含量测定。

(4)在研究过程中不断优化供试品处理方法，以不同浓度乙醇溶液，进行提取比较；并采用回流提取和超声波提取方法进行对比。最终选择80%乙醇作为提取溶媒，采用加热回流的提取方式进行提取。结果：样品及对照品基线较好，样品中丹皮酚峰与相邻各杂质峰分离较好。

(5)本方法操作简便，重复性好，精密度、准确度高。通过多批次样品的验证，可用于评价宣痹通络颗粒质量的稳定性。