超高效液相色谱-串联质谱法测定淡水养殖 用水中25种抗生素

李小梅，李丽珍，何春慧，张丽姬，王河丹，吴学贵

（海南威尔检测技术有限公司，海南澄迈 571924）

抗生素类种类繁多，在人们的防治感染性疾病和动物的抗菌促生长等方面应用较广。抗生素滥用或过度使用会导致人和动物对其产生耐药性[1]。在水产养殖中，抗生素的作用主要是预防和治疗疾病，提高水产动物的存活率[2]。因此，在全球的水产养殖业中，抗生素被大量使用，对人体健康造成一定危害[3]。本文建立了固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法[4]检测淡水养殖用水中的25种抗生素类残留检测，为检测淡水养殖用水中磺胺类和喹诺酮类抗生素残留提供可靠的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星、洛美沙星、氟甲喹、丹诺沙星、双氟沙星、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺甲嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺醋酰、磺胺多辛、磺胺甲恶唑、磺胺氯哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲二唑、磺胺二甲嘧啶和甲氧苄啶标准品（纯度均≥97.00%，Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；盐酸（优级纯，广州牌化学试剂）；甲醇、乙腈（色谱纯，北京百灵威科技有限公司）；乙二胺四乙酸二钠（分析纯，广东光华科技股份有限公司）；Oasis HLB小柱（Waters公司）。

1.2 仪器与设备

Agilent1290/G6470A超高效液相色谱-串联质谱（美国Agilent Technologies公司）；AB204-S电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；TTLDCII氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

取500 mL过滤后的淡水养殖用水水样用盐酸溶液酸化后，加入乙二胺四乙酸二钠200 mg，混匀后过HBL小柱净化、提取，用12 mL甲醇洗脱，洗脱液吹至近干，加入1 mL流动相（0.5 mmol乙酸铵-0.1%甲酸溶液∶乙腈=9∶1），混匀后过滤膜，滤液供超高效液相色谱-串联质谱仪分析。

1.3.2 标准工作溶液的配制

分别准确称取25种抗生素固体标准品10.0 mg，加入适量甲醇超声溶解，配制成质量浓度为10 mg/L的标准储备溶液，待用。移取适量10 mg/L的标准储备溶液，用甲醇稀释成0.1 mg/L的标准中间液。用流动相（0.5 mmol乙酸铵 -0.1% 甲酸溶液∶乙腈 = 9 ∶ 1）稀释标准中间液，分别配制成质量浓度为 0.1 ng/L、0.5 ng/L、1.0 ng/L、2.0 ng/L、5.0 ng/L、10.0 ng/L、25.0 ng/L和50.0 ng/L的标准工作溶液。

1.3.3 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：Poroshell 120 EC-C18（50 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱温：35 ℃；进样量：2 μL；流动相A为0.5 mmol乙酸铵-0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱：0 min，95%A，3.5 min时，88%A，4.0 min时，86%A，7.0 min时，63%A，7.1 min时，5%A，8.7 min时，5%A，8.8 min时，95%A；流速：0.3 mL/min。

（2）质谱条件。离子源为电喷雾离子源AJS ESI，正离子模式；毛细管电压：4000 V；离子源温度：300 ℃；鞘气温度：350 ℃；检测方式为多反应监测。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件优化

参考2008年农业部发布的《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[5]磺胺类和喹诺酮类检测方法，本文用盐酸溶液和氨水调节水样pH为酸性2.5、弱酸性5.2和近中性7.7，研究水质酸碱度对回收率的影响，每个样品在不同pH条件下平行加标6个，浓度为 10 ng/L，结果见表1。实验表明pH为2.5时，平均回收率较高且相对稳定。因此，本文选择将淡水养殖用水pH调节为2.5进行实验。

表1 不同pH条件下药物的平均回收率及RSD（单位：%）

2.2 标准曲线绘制

按照优化后的条件和方法对标准工作溶液进行分析测定，以目标化合物标准溶液浓度为横坐标x、峰面积为纵坐标y，绘制标准曲线。25种抗生素药物的线性关系见表2，相关系数为0.99061～0.99983。

表2 抗生素药物的线性方程

2.3 方法检出限

用阴性样品加标处理，用流动相稀释混合标准溶液，以信噪比（S/N）=3为方法检出限。如图1所示，淡水养殖用水中磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、氧氟沙星和环丙沙星5种抗生素检出限为 0.1 ng/L，磺胺甲恶唑、恩诺沙星、丹诺沙星和氟甲喹4种抗生素检出限为0.2 ng/L，甲氧苄啶、磺胺氯哒嗪、磺胺多辛、磺胺醋酰、磺胺吡啶、双氟沙星、洛美沙星和培氟沙星8种抗生素检出限为0.5 ng/L，磺胺二甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺异恶唑、诺氟沙星和沙拉沙星8种抗生素的检出限为1.0 ng/L。因此，该方法的检测灵敏度较高。

图1 淡水养殖用水中25种抗生素检出限

2.4 回收率与精密度实验

本文选择将淡水养殖用水pH调节为2.5进行实验，采用加标回收法进行回收率和精密度实验，分别计算出的磺胺类药物平均回收率为100.7%～115.4%，RSD为1.05%～4.69%，喹诺酮类药物平均回收率为90.1%～111.0%，RSD为2.20%～9.55%，各项指标均符合要求。

2.5 样品检测

按照优化后的实验条件对4处淡水养殖用水中25种抗生素进行检测。如图2所示，淡水养殖用水中25种抗生素在8 min内全部出峰，出峰时间较快，提高了检测效率。

图2 淡水养殖用水中25种抗生素出峰时间

3 结论

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱法对淡水养殖用水中25种抗生素进行检测，该方法25种抗生素出峰时间快，检出限为0.1～1.0 ng/L，相关系数为0.99061～0.99983，磺胺类药物平均回收率为100.7%～115.4%，RSD为1.05%～4.69%，喹诺酮类药物平均回收率为90.1%～111.0%，RSD为2.20%～9.55%。该方法快速、稳定、灵敏度和准确度高，适用于淡水养殖用水中磺胺类和喹诺酮类药物检测。