利用新会柑果浆培养海洋假丝酵母的发酵工艺

李义勇，陈柏忠，沈许源，叶伟，吴振强

1. 华南理工大学生物科学与工程学院（广州 510006）；2. 广东新宝堂生物科技有限公司（江门 529101）；3. 黑龙江大学生命科学院（哈尔滨 150080）；4. 广东省科学院微生物研究所（广州 510070）

海洋假丝酵母（Candida orthopsilosis）是近年来单分出的种属[1]，无明显致病性，无抗性也不耐药[2]，具耐酸、耐高温等环境适应能力[3]，并且表现出良好的拮抗作用[4]，对水果霉病有抑制作用，可用于生产可食保鲜膜[1]，具有广阔的开发利用前景[5]。前提条件是实现海洋假丝酵母的规模化发酵培养，但却鲜有该方面的报道。为了实现对海洋假丝酵母的工业化大规模生产，一方面需要采用廉价易得的培养基，另一方面需要降低发酵工艺要求。

新会陈皮是中国地理标志产品，为广东省十大道地药材之首，药用价值以及经济价值极高。陈皮取自新会柑的果皮，而果肉因味酸、口感不佳、产量巨大、又不耐存放等原因被当作废料处理，丢弃量达20万 t/年，对周边的土壤和水体环境造成不良影响。为此，当地政府鼓励企业采用多种途径开发利用新会柑果肉，包括制作酵素、酿造果酒和生产有机肥，但仍只能消纳小部分（约20%）。果肉丢弃现象仍然普遍存在。有研究表明，新会柑果肉营养丰富，其果浆可以直接作为培养基使用[6]。

前期从新会柑果肉中分离到1株内生真菌，经鉴定为海洋假丝酵母，且该菌株在新会柑果浆中生长良好。为研发基于新会柑果浆的海洋假丝酵母培养技术，试验在开放式环境下，探讨果浆稀释与牛肉浸粉/葡萄糖/CaCO3添加等工艺条件对海洋假丝酵母生长的影响，获得优化的工艺条件，为后续大规模的利用新会柑果浆培养海洋假丝酵母提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 海洋假丝酵母

1株分离自新会柑果肉的内生真菌，经鉴定为海洋假丝酵母C.orthopsilosis，保藏于广东省微生物研究所药用真菌课题组。

1.2 材料与试剂

新会柑果浆，将-30 ℃冷冻保存的新会柑果肉自然解冻后，经挤压和纱布过滤，得到的液体即为果浆，其主要成分为：总糖6.78 g/100 mL，其中还原糖3.95 g/100 mL；总酸1.192 5 g/100 mL，pH 3.70；维生素C 0.021 4 g/100 mL。

牛肉浸粉（广东环凯微生物科技有限公司）；CaCO3、葡萄糖（广州东巨实验仪器有限公司）。

1.3 仪器与设备

HZQ-X500C恒温振荡器（上海一恒科学仪器有限公司）；HT-CJ-2S无菌操作台（安徽航天生物科技有限公司）；LDZX-75KBS立式高压蒸汽灭菌锅（上海中安医疗器械厂）。

1.4 培养基

基础培养基：新会柑果浆，现制现用。

营养肉汤琼脂培养基、马丁培养基、PDA培养基：均参照NY/T 2321—2013《微生物肥料产品检验规程》附录B配制[7]。

1.5 试验方法

1.5.1 基础培养条件

取250 mL三角锥形瓶，装入100 mL的培养基，在摇床中进行有氧发酵。接种量10%、培养温度30 ℃、自然pH、摇床转速120 r/min、培养周期24 h。

1.5.2 试验设计

1.5.2.1 海洋假丝酵母直接开放式发酵

从活化后的海洋假丝酵母斜面上刮取1环菌苔，置于10 mL无菌生理盐水中，制成菌悬液，将制得的菌悬液稀释10倍后以1∶10的比例接种至装有基础培养基（未灭菌）的洁净三角锥形瓶中，直接进行开放式发酵。24 h后，测定发酵液中的活菌数，并检测杂菌数。

1.5.2.2 海洋假丝酵母培养条件优化

在直接开放式试验的基础上，改变果浆稀释倍数（以无菌水为溶剂，稀释0，2，4，6，8和10倍）、牛肉浸粉添加量（0，0.070，0.125，0.250，0.500和1.000 g）、葡萄糖添加量（0，0.250，0.500，1.000，2.000和4.000 g）及CaCO3添加量（0，0.025，0.050，0.075，0.100和0.125 g），探讨这些条件对海洋假丝酵母生长的影响。每批次试验后测定24 h时的发酵液活菌数，确定最佳生长条件。

1.5.3 活菌数的测定

采用平板菌落计数法，其菌落计数方法参照NY/T 2321—2013[7]进行。

1.5.4 杂菌数的测定

采用平板菌落计数法，其结果计算方法参照NY/T 2321—2013[7]进行。

2 结果与分析

2.1 海洋假丝酵母直接开放式发酵

前期研究表明，在基础培养基平板上，该菌株的菌落为乳白色，质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一（见图1），说明新会柑果浆可直接作为该菌株的培养基使用。

图1 海洋假丝酵母菌落形态

经直接开放式发酵发现，该菌可适应新会柑果浆酸性环境，无需外加任何营养物质，在新会柑果浆中生长良好，发酵培养24 h后的活菌数可达6.5×107CFU/mL，无杂菌发生，发酵液pH 4.01，且气味正常，无腐败气味。值得指出的是，一般认为，在开放式发酵体系中，未灭菌的发酵原料及空气环境会带入一定量杂菌，因此应该采取措施抑制杂菌生长[8]。试验中未发现杂菌，可能的原因是新会柑果浆原料（果肉）本身相对洁净，且该菌株为新会柑果肉内生真菌，本身更容易占据生态位优势。

2.2 海洋假丝酵母培养条件优化

为进一步提高活菌数，探讨果浆稀释和牛肉浸粉/葡萄糖/CaCO3添加等条件对海洋假丝酵母生长的影响。

2.2.1 不同果浆稀释倍数对海洋假丝酵母生长的影响

有研究表明，适度降酸有利于酵母菌生长[9]。由于新会柑果浆呈明显酸性（pH 3.70），可能对海洋假丝酵母存在不良影响，因此，考察果浆稀释度对该菌株生长的影响，结果见图2。

图2 不同果浆稀释倍数对海洋假丝酵母生长的影响

由图2可知，随着稀释度增加，活菌数呈现先增加后减少趋势，说明直接使用新会柑果浆仍会对该菌株产生一定抑制作用，而适当稀释可以缓解此抑制作用，有利于该菌株的生长。然而，过度稀释可能造成营养成分不足，反而不利于该菌株的生长。可见，最佳条件为果浆稀释4倍，此时活菌数达到7.8×108CFU/mL，最终pH为4.00。

2.2.2 不同牛肉浸粉添加量对海洋假丝酵母生长的影响

氮源对酵母菌生长有显著影响，且有机氮源对酵母生长的促进作用要大于无机氮源[10-11]，故考察不同牛肉浸粉添加量对海洋假丝酵母生长的影响，结果见图3。

由图3可知，随着牛肉浸粉添加，活菌数呈现先快速增加后缓慢减少的趋势，说明适量补充牛肉浸粉十分有利于该菌株的生长。然而，过量添加的作用不大，因为所能提供的营养已经饱和。为节省发酵原料，建议最佳条件为0.125 g/L，此时活菌数达到1.7×108CFU/mL，最终pH为4.06。

图3 不同牛肉浸粉添加量对海洋假丝酵母生长的影响

2.2.3 不同葡萄糖添加量对海洋假丝酵母生长的影响

有研究表明，适当提高糖度可以更好地满足酵母菌生长[9]，故考察不同葡萄糖添加量对海洋假丝酵母生长的影响，结果见图4。

图4 不同葡萄糖添加量对海洋假丝酵母生长的影响

由图4可知，随着葡萄糖添加量增加，活菌数呈现先稳步增加后快速减少趋势，说明适当补充葡萄糖的确有利于该菌株的生长。然而，一旦添加过量，其副作用立即凸显。因此，建议最佳条件为1.000 g/L，此时活菌数达4.7×108CFU/mL，最终pH为4.67。

2.2.4 不同CaCO3添加量对海洋假丝酵母生长的影响

除了2.2.1的稀释法降酸，还可通过添加CaCO3调节酸性，因此，考察不同CaCO3添加量对海洋假丝酵母生长的影响，结果见图5。

由图5可知，随着CaCO3添加，活菌数呈现先缓慢后快速增加的趋势，说明补充一定量的CaCO3的确有利于该菌株的生长。然而，添加量0.125 g/L时，开始出现CaCO3未被完全利用的情况。因此，建议最佳条件为0.125 g/L，此时活菌数达到5.0×109CFU/mL，最终pH为4.75。

图5 不同CaCO3添加量对海洋假丝酵母生长的影响

综上可见，牛肉浸粉添加、葡萄糖添加、果浆稀释度和CaCO3的添加对海洋假丝酵母生长都产生明显影响，且影响程度依次增强。其最优工艺条件为牛肉浸粉添加量0.125 g/L、葡萄糖添加量1.000 g/L、果浆稀释4倍和CaCO3添加量0.125 g/L。

2.3 海洋假丝酵母最佳培养工艺

在优化工艺条件下，其活菌数可达9.5×109CFU/mL，且随之发生絮凝现象（图6），从而有利于后续回收利用[12]。

图6 海洋假丝酵母的絮凝现象

通过试验发酵工艺，一方面可以充分利用廉价易得的新会柑果浆培养基，另一方面可以降低对无菌发酵的严格工艺要求，能够更好地满足海洋假丝酵母的工业化大规模生产需求。既获得了有价值的海洋假丝酵母，又实现新会柑果肉的资源化利用，具有经济和环保双重效益。

3 结论

新会柑果浆可直接作为海洋假丝酵母菌株的培养基使用。经直接开放式发酵培养24 h后，活菌数可达6.5×107CFU/mL，无杂菌发生。

牛肉浸粉添加量、葡萄糖添加量、果浆稀释度和CaCO3添加量等对海洋假丝酵母生长都产生了明显影响，且影响程度依次增强。其最优工艺条件为牛肉浸粉添加量0.125 g/L、葡萄糖添加量1.000 g/L、果浆稀释4倍和CaCO3添加量0.125 g/L。

在最优工艺条件下，其活菌数可达9.5×109CFU/mL，且随之发生絮凝现象，有利于后续回收利用。

采用新会柑果浆开放式培养海洋假丝酵母是可行的，不仅培养基廉价易得，而且发酵和回收便利，能够满足工业化大规模生产需求，既获得有价值的海洋假丝酵母，又实现新会柑果肉的资源化利用。