桃金娘果多糖的制备及其免疫增强作用研究

卢光强，刘 伟，曾雪颜，赵 武，姜源明，银慧慧

(1.广西隆安县动物疫病预防控制中心，南宁 532799；2.广西壮族自治区兽医研究所,广西兽医生物技术重点实验室，南宁 530001)

植物多糖已被证实具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节和抗糖尿病活性等生物活性，在生命科学和医药科学中都得到广泛的应用[1-2]。目前，抗生素的不规范使用以及抗生素残留和抗药性问题日趋严重，一些抗生素能够通过动物性食品转移到人体中，对人类的健康造成了严重威胁。植物多糖与抗生素作用性质相同，并且具有高效、低毒、无残留等优点。已有研究发现，在肉仔鸡饲料中添加一定量的黄芪多糖，能够改善三黄肉鸡的生长性和其肠道微生物菌群系统[3-4]；在饲粮中添加复合益生菌和黄芪多糖能够提高生长育肥猪的免疫功能[5]；茯苓多糖和白术多糖能显著提高仔猪生长性能[6-7]；马尾藻多糖可以促进猪和鸡脾脏淋巴细胞增殖[8-9]。这些研究显示，植物多糖作为一种绿色新型畜禽用饲料添加剂得到了广泛关注。桃金娘Rhodomyrtustomentosa(Ait.) Hassk.为桃金娘科桃金娘属常绿多花小灌木，是我国南方地区民间传统习用中草药，自然分布在热带及亚热带，我国主要生长在南部各省[10]。据《全国中草药汇编》记载，桃金娘性味甘、涩、平，全株可供药用，具有活血通络、收敛止泻、补虚止血功效。当前对桃金娘的化学成分及生物活性有了比较深入的研究[11-12]，但对桃金娘多糖的作用机制研究较少。本研究通过制备桃金娘果多糖，初步探究桃金娘果多糖在小鼠体内的免疫调节作用，为加大桃金娘的药用开发力度，用于促进动物生长和提高动物免疫力提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 桃金娘果(产地：广西玉林，经广西兽医研究所兽药新技术开发中心鉴定为桃金娘果实，干燥后打粉，过四号筛)。小鼠白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素6(IL-6)、γ干扰素(IFN-γ)、过氧化物酶(POD)试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；溶菌酶(LZM)试剂盒购自上海联酶生物科技有限公司；生理盐水购自江西御医堂实业有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器 Nicolet iS5傅里叶变换红外光谱仪(赛默飞世尔科技公司)；1260型液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；Cary 50紫外分光光度计(美国瓦里安公司)；分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；TECAN model Infinite M200酶标仪(瑞士帝肯公司)，恒温水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司)；RE-2000A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.3 动物和饲料 SPF级昆明小鼠80只，雌雄各半，体重(20±2)g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供。实验期间动物房温度18～22 ℃，湿度50%～60%，小鼠自由摄食及饮水，适应性饲养4 d后进行实验。SPF饲料由长沙市天勤生物技术有限公司提供。

1.4 方法

1.4.1 桃金娘果多糖的制备 采用水浴提取法，料液比1∶10，提取温度80 ℃，提取时间90 min，过滤后旋转蒸发仪浓缩，再按10∶1的比例加入5%的101果汁澄清剂，搅拌混匀室温放置12 h后离心，上清液用95%乙醇醇沉，离心，沉淀挥干试剂，水复溶，用10 ku半透膜流动纯化水透析12 h，95%乙醇醇沉，干燥得桃金娘果多糖。

1.4.2 桃金娘果多糖的含量测定 准确称取桃金娘果多糖样品3份， 溶解后采用苯酚-硫酸法[13]测定其吸光度，从回归方程中求出桃金娘果多糖含量。多糖含量按照下式计算：

式中，m-多糖质量(mg)；c-多糖溶液中糖质量浓度(μg/mL)；V-供试液的体积(mL)；D-多糖稀释倍数；a%-桃金娘果粉末水分含量；0.9-葡萄糖对多糖的校正系数。

1.4.3 单糖组分分析 参照文献方法[14]，分别取1 mL多糖溶液(4 mg/mL)于水解瓶中，加入1 mL 4 mol/L的三氟乙酸溶液，在110 ℃下孵育3 h，冷却至室温后氮气吹干，然后加入1 mL纯水溶解得到水解样品。在0.5 mL水解样品中加入0.3 mol/L的NaOH溶液和0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液各0.5 mL，在70 ℃下避光孵育100 min，冷却至室温后加入0.5 mL 0.3 mol/L HCL溶液，混匀得到衍生化样品。衍生化样品用氯仿萃取除去PMP，水相离心后取上清液进行测定。单糖混合对照品溶液同上进行衍生化。

色谱条件：ZORBAX SB-C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相为乙腈-磷酸盐缓冲液(pH 6.7)=17∶83(体积比)；检测波长254 nm；流速为1.0 mL/min。

1.4.4 实验动物分组及给药 将80只昆明种小鼠随机平均分成空白组、黄芪多糖组、桃金娘果多糖低、中、高剂量组共5组。黄芪多糖组每只小鼠按200 μg/(g·BW)剂量腹腔注射黄芪多糖混悬液，桃金娘果多糖低、中、高剂量组分别按50、100、200 μg/(g·BW)剂量腹腔注射桃金娘果多糖混悬液，空白组每只小鼠腹腔注射等体积的生理盐水0.02 mL/(g·BW)，1 次/d，连续给药7 d。

1.4.5 小鼠脏器指数测定 于末次给药后禁食不禁水12 h，对所有小鼠进行称重。眼球采血，分离血清，置于-20 ℃冰箱保存待用；颈椎脱臼处死小鼠，取其胸腺、脾脏洗净、吸干后称量，按下式公式计算免疫器官指数。

1.4.6 小鼠血清细胞因子含量测定 于末次给药后禁食不禁水12 h，对所有小鼠进行称重。眼球采血，分离血清，根据试剂盒说明书检测血清中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、(γ干扰素)IFN-γ、溶菌酶(LZM)、过氧化物酶(POD)指标的含量。

1.4.7 数据处理 试验数据均以± s表示, 用SPSS17.0软件对结果进行统计分析和邓肯氏多重比较，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 桃金娘果多糖含量测定及组分分析 按照1.4.2项测定不同浓度葡萄糖标准溶液的吸光度，得到吸光度值y对浓度c的回归方程为：y=0.0722x+0.0132(R2=0.9992)，葡萄糖标准溶液在0～80.57 μg/mL 浓度范围内呈良好的线性关系。按照1.4.1项提取得到的桃金娘果多糖含量为65.83±1.40%。

随后对桃金娘果多糖进行组分分析，表明桃金娘果多糖至少由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成(图1)，其物质的量比为0.08∶0.01∶0.08∶1.00∶0.08∶0.01∶0.06。

A-混合单糖对照品；B-多糖水解单糖样品1、甘露糖；2、鼠李糖；3、半乳糖醛酸；4、葡萄糖；5、半乳糖；6、木榶；7、阿拉伯糖。A- Mixed monosaccharide reference substance; B-Polysaccharide hydrolysis monosaccharide sample1. mannose; 2. rhamnose; 3. galacturonic acid; 4. Glucose; 5. Galactose; 6. xylose; 7. arabinose图1 桃金娘果多糖中各单糖液相色谱图Fig 1 Liquid chromatography diagram of monosaccharidesin Rhodomyrtus tomentosa fruit polysaccharide

2.2 桃金娘果多糖对小鼠免疫器官指数的影响 桃金娘果多糖对健康小鼠脾脏、胸腺指数的影响见表1，桃金娘果多糖中、高剂量组的胸腺指数与空白组比较明显下降，差异显著(P<0.05)，桃金娘果多糖中、低剂量组和黄芪多糖组与空白组比较胸腺指数有所降低但无显著差异(P>0.05)。与空白组比较，黄芪多糖组以及桃金娘低、中、高剂量组的脾脏指数显著性增高(P<0.05)。

表1 桃金娘果多糖对健康小鼠免疫器官指数的影响Tab 1 Effect of Rhodomyrtus tomentosa polysaccharide on immune organ index of healthy mice

同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)(下同)。

2.3 桃金娘果多糖对小鼠血清细胞因子的影响 由表2看出，与空白组比较，桃金娘果多糖中、高剂量组显著提高了IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ血清细胞因子的水平(P<0.05)；桃金娘果多糖低剂量组的IL-2、IL-1β、IL-6、IFN-γ细胞因子与空白组比较无显著差异(P>0.05)；黄芪多糖组则显著提高了IL-6血清细胞因子含量，差异显著P值<0.05。

表2 桃金娘果多糖对健康小鼠细胞因子水平的影响Tab 2 Effect of Rhodomyrtus tomentosa fruit polysaccharide on cytokine levels in healthy mice

2.4 桃金娘果多糖对小鼠溶菌酶和过氧化物酶的活性影响 桃金娘果多糖对小鼠溶菌酶和过氧化物酶的活性影响见表3。由表3可知，与空白组比较，黄芪多糖组和桃金娘果多糖低、中剂量组均可显著增加小鼠的POD活性(P<0.05)，桃金娘果多糖低、中、高剂量组小鼠的LZM含量得到了显著提高(P<0.05)，黄芪多糖组与空白组比较LZM含量显示无统计学意义(P>0.05)。

表3 桃金娘果多糖对健康小鼠POD和LZM活性的影响Table 3 Effect of Rhodomyrtus tomentosa fruit polysaccharide on the activity and content in healthy mice

3 讨论与小结

桃金娘是一种食药同源的野生药用植物资源，富含多糖、黄酮类、酚类等多种生物活性成分。本研究提取得到的桃金娘果多糖含量为65.83%，主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成。作为重要的免疫器官，胸腺和脾脏重量的变化能够直接反映药物对机体免疫应答的强弱。研究显示[15-16]，多糖对小鼠的胸腺和脾脏具有一定的修复作用。本试验的研究结果表明，桃金娘果多糖显著提高小鼠的脾脏指数，但桃金娘果多糖高剂量显著降低了小鼠的胸腺指数，提示桃金娘果多糖对小鼠的免疫器官有一定的影响，浓度越高，影响越大。促炎细胞因子IL-1β主要参与细胞增殖、分化和凋亡等多种细胞活动以及免疫性炎症反应等。IL-2细胞因子又称T 细胞生长因子，具有B细胞增殖、活化T细胞、NK细胞功能等生物功能作用。IFN-γ是机体免疫反应的主要调节剂，是激活免疫细胞的关键信号分子。IL-6具有B细胞分化生物功能，参与T细胞的早期激活。有研究显示[17-18]，青蒿多糖和山药多糖能够调节机体的IL-2、IL-1β、IL-6、IFN-γ水平，促进细胞因子的分泌等。本试验结果显示，桃金娘果多糖中、高剂量组显著提高了IL-1β、IL-2、IL-6、IFN-γ血清细胞因子的水平，提示桃金娘果多糖可通过调节细胞因子水平而对机体的免疫功能进行调节。

过氧化物酶POD能够将氧化还原反应中产生的细胞毒性物质过氧化氢水解，并达到保护细胞的作用。溶菌酶LZM能够发挥催化作用破坏某些细菌细胞壁，从而保护机体不受细菌的感染。有研究显示[19-20]，黄芪多糖和山豆根多糖对POD和LZM具有调节作用。本研究结果显示，桃金娘果多糖低、中剂量组均可显著增加小鼠的POD活性，桃金娘果多糖低、中、高剂量组小鼠的LZM含量得到了显著提高。

桃金娘果多糖具有改善小鼠免疫功能的作用。在本试验条件下，桃金娘果多糖能够显著提高健康小鼠的脾脏指数、细胞因子IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-2、POD和LZM的含量，但浓度过高会引起小鼠胸腺萎缩。这一研究结果为桃金娘在饲料添加剂、动物保健及药用资源的深度开发和应用等方面提供一定的参考依据。