盐胁迫下茉莉酸甲酯调控紫花苜蓿幼苗生长机制研究

崔 凯 吴连军 张靖媛

（1赤峰市森林草原保护发展中心，内蒙古赤峰 024000；2赤峰市林业科学研究所，内蒙古赤峰 024000）

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）原名为紫苜蓿，又名苜蓿，属于蔷薇属豆科多年生草本植物。其主要呈栽培或半野生状态，分布广泛，在田边、路旁、旷野、草原等地均可以生长，并被广泛种植。紫花苜蓿主要作为饲料或者牧草之用，其营养价值居牧草之首，有“牧草之王”的美誉。紫花苜蓿具有较高的应用价值[1]。

研究发现，盐胁迫是制约植物生长的主要逆境因子之一。了解盐胁迫条件下的植物应答机制，筛选更多的耐盐植物，对盐碱地改良具有重要意义[2-4]。通常将盐土、碱土和各种盐化、碱化的土壤统称为盐碱土、盐渍土或盐碱地[5]。全球目前有20%～50%的水浇地受到盐碱的影响，尤其我国农业生产受盐碱地影响严重。因此，进行适当的农业产业结构调整，积极应对生态环境变化，发展牧草饲料作物，有利于促进我国环境治理和农业发展[6]。

茉莉酸甲酯属于茉莉酸类化合物，是广泛存在于植物体内的一种生物调节剂。其在植物应答非生物和生物胁迫的反应中具有信号转导功能，是植物受胁迫信号通路中不可缺少的部分[7-8]。研究发现，茉莉酸甲酯可诱导植物防御机制，以应对病原体、伤口和环境胁迫[9]。茉莉酸甲酯是一种细胞调节因子，主要参与植物生长、果实发育、种子萌发等过程。分子学研究发现，与茉莉酸甲酯相关的基因在不同胁迫条件下的表达也发生了变化，并且这种变化有助于提高植物抗性[10]。本研究探讨了施加外源茉莉酸甲酯后紫花苜蓿对盐胁迫的应答机制，以期为盐胁迫下茉莉酸甲酯调控苜蓿幼苗生长研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为紫花苜蓿，由黑龙江省农业科学院提供，种子发芽率为98%。

1.2 试验方法

1.2.1 NaCl胁迫浓度的筛选。选大小一致的紫花苜蓿种子，播于培养皿上进行催芽。当种子出芽后，挑选出芽一致的种子进行水培，水培液体采用Hoagland营养液，隔1 d更换1次营养液，同时添加0、50、100、150、200、250、300 mmol/L NaCl进行相应处理。 6 次重复，培育环境条件为25℃，光照培养8 h，黑暗培养16 h；培育7 d后，观察幼苗生长情况，并拍照。

1.2.2 NaCl胁迫条件下外源施加茉莉酸甲酯对紫花苜蓿的影响。将1.2.1筛选出的最佳NaCl胁迫浓度用于此项试验中。试验设4个处理，分别为外源施加0.1 mg/mL茉莉酸甲酯处理（A）、外源施加0.1 mg/mL茉莉酸甲酯+200 mmol/L NaCl处理（B）、200 mmol/L NaCl处理（C），以不添加外源物质的Hoagland营养液作为对照（CK）。具体方法为：选大小一致的紫花苜蓿种子，播于培养皿上进行催芽；当种子出芽后，挑出芽一致的种子进行水培，水培液采用Hoagland营养液，隔1 d更换1次，同时添加上述外源物质进行相应处理；每个处理6次重复，培育环境条件为25℃，光照培养8 h，黑暗培养16 h；培育7 d后，观察植株形态并拍照，同时测定部分生理指标。

1.3 测定指标

1.3.1 激素含量的测定。采用酶联吸附免疫法分别测定叶片和根系内的激素含量。具体方法为：将抗激素的单克隆抗体与已固相载体上的Ig抗体结合，然后加入激素标准品或待测样品，使其与单克隆抗体结合，再加入酶标激素。通过测定酶标激素的被结合量，换算未知样品中激素数量[11]。

1.3.2 其他各项生理指标的测定。植株长度和根系长度经过拍照后采用WinRHIZO Pro 5.0a软件测定根系长度；采用称重法测定相对含水量[12]；利用酸性印三酮测定脯氨酸含量[12]；采用硫代苯巴比妥法测定丙二醛含量[12]；采用蒽酮法测定可溶性糖含量[12]；采用愈创木酚法测定过氧化物酶活性[13]；采用四啖唑蓝法测定超氧化物歧化酶活性[13]；采用分光光度法测定过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶的活性[13]。

1.4 数据分析

试验数据采用SPSS 22.0软件进行方差分析处理，采用GraphPad Prism 7.03软件作图。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫浓度的筛选

筛选紫花苜蓿苗期生长的最佳NaCl胁迫浓度的基本原则是既可以让紫花苜蓿植株生长受到一定程度的抑制又不会使其死亡。本研究利用7种NaCl浓度梯度对紫花苜蓿植株进行处理，结果见图1。可以看出，随着NaCl浓度的提高，植株形态发生了改变。当浓度为250、300 mmol/L时植株叶片出现萎蔫干枯现象，根系呈现褐色，植株近乎干枯死亡；当NaCl浓度为200 mmol/L时，紫花苜蓿植株萎蔫但是未死亡。因此，本研究选择200 mmol/L作为NaCl胁迫浓度。

2.2 NaCl胁迫条件下外源施加茉莉酸甲酯对紫花苜蓿的影响

2.2.1 植株形态变化情况。从图2（b）可看出，与CK相比，处理A紫花苜蓿植株高度减少且根系缩短，但分枝明显，根系相对粗壮。从图2（d）可看出，与CK相比，处理C植株分枝减少，且根系分枝也减少，植株整株干枯死亡。综合来看，在施加外源茉莉酸甲酯后，在一定程度上可缓解由于NaCl胁迫处理后的植株干枯死亡现象，且可在一定程度上促进植株生长。

从表1可以看出：CK植株根系分枝较多，且根系呈白色，同时植株生长状态正常；处理C植株变得矮小，根系缩短，但分枝较多；处理A根系分枝减少，植株变矮并且萎蔫，根系呈褐色；处理B植株高度、根系长度与CK相比差异不显著，只是植株细弱，但是与处理C相比植株生长状态有所恢复。

表1 不同处理下紫花苜蓿植株形态变化情况

2.2.2 相对含水量、丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量变化情况。从图3、4可以看出：与CK和处理A相比，处理C叶片和根系的相对含水量均有所降低；处理B叶片和根系的相对含水量较处理C有所恢复。与CK相比，处理A叶片和根系的丙二醛含量并未表现明显差异，但处理B丙二醛含量显著升高。与CK相比，处理A叶片中的脯氨酸含量显著提高，但是根系内脯氨酸含量变化不显著，处理C叶片和根系的脯氨酸含量显著下降；处理B叶片和根系的脯氨酸含量较处理C均显著恢复。与CK相比，处理C叶片和根系内的可溶性糖含量下降，处理A、B可溶性糖含量升高，而且两者之间差异不显著。

2.2.3 内源激素含量变化情况。如图5所示：与CK相比，处理A、B、C叶片内脱落酸、吲哚乙酸的含量均呈现下降趋势，处理A叶片内玉米素、赤霉素含量增加。如图6所示：与CK相比，处理A根系内玉米素、脱落酸含量增加，吲哚乙酸和赤霉素的含量均降低；处理B、C根系内4种内源激素的含量均较CK降低。

2.2.4 抗氧化酶活性变化情况。由图7可知：处理C叶片过氧化物酶活性显著低于CK以及处理A、B，处理A、B与CK之间差异不显著；处理A叶片超氧化物歧化酶活性最低，并且显著低于其他处理，处理B可以显著提高叶片超氧化物歧化酶活性；处理A叶片过氧化氢酶活性显著高于CK以及处理B、C，处理C叶片过氧化氢酶活性较CK显著下降；处理A、B、C叶片抗坏血酸过氧化物酶活性较CK下降，处理A叶片抗坏血酸过氧化物酶活性显著高于处理B和处理C。

由图8可知：处理B、C根系过氧化物酶活性低于CK和处理A；处理A、B、C、CK根系超氧化物歧化酶活性和过氧化氢酶活性差异均不显著；处理C根系抗坏血酸过氧化物酶活性显著低于CK和处理A、B，且差异显著。

3 结论与讨论

通常情况下，在盐胁迫条件下，会造成植物渗透胁迫或离子毒害、活性氧暴发，从而导致植物体内水分失衡，进而破坏膜结构，影响膜功能，使植株生长受到抑制，终致植株死亡[14]。本研究中选取NaCl作为盐胁迫条件，观察紫花苜蓿植株生长变化特征。结果发现，随着盐胁迫浓度的增加，给紫花苜蓿造成了一定的影响。杨跃霞[14]利用NaCl模拟盐胁迫研究紫花苜蓿应答盐胁迫反应机制，结果发现NaCl适合用于模拟植物盐胁迫试验。

大量研究表明，一些植物激素可有效缓解盐胁迫等逆境条件给植株造成的损伤[15]。例如水杨茉莉酸在一定条件下可缓解逆境对紫花苜蓿的伤害[16]。茉莉酸甲酯广泛存在于植物体内。研究发现，通过外源施加茉莉酸甲酯可有效激发防御基因表达，诱导植株发生防御反应。本文针对茉莉酸甲酯如何缓解盐胁迫对紫花苜蓿幼苗生长所造成的影响展开研究，同时测定了膜系统变化、抗氧化系统和抗氧化物质等指标。结果发现，茉莉酸甲酯可促进紫花苜蓿叶片和根系的激素积累，可通过有效调节内源激素脱落酸、玉米素、赤霉素、吲哚乙酸等调控紫花苜蓿幼苗生长。

植物在受到盐胁迫后，人们可通过植株形态及生理指标的改变来判断其被逆境影响的程度。其中植物组织相对含水量可用来表示逆境条件下植物体内水分变化情况及所处的生长状态，并可反映植物生存活力[17]。通常来说，在盐胁迫条件下，会使植物产生一定的生理伤害，从而造成吸水障碍，进而导致细胞含水量降低，发生膜质过氧化，相应地会导致丙二醛累积增加、膜系统破坏，增加的膜透性可直接导致电解质外渗，从而引起相对电导率升高[18]。本文发现：紫花苜蓿在受到NaCl胁迫的条件下，与未添加外源对照相比，叶片和根系各项指标均有一定程度的改变，其中地上组织和地下组织均有大量丙二醛产生，而脯氨酸和可溶性糖含量并不高，但施加外源茉莉酸甲酯后，可有效提高脯氨酸和可溶性糖含量，同时降低丙二醛含量。这说明外源茉莉酸甲酯可能通过调节一些物质的产生来抵御NaCl胁迫，使其具有了一定的耐受性。在NaCl胁迫过程中，丙二醛含量出现升高现象，而植株可通过提高可溶性糖和脯氨酸等渗透调节物质的含量进行调节，从而起到一定的保护作用[19]。与此同时，不同处理植株含水量及电导率均发生改变，说明该试验的不同处理对植株均造成了影响，筛选的处理条件较适宜。茉莉酸甲酯可显著诱导紫花苜蓿体内抗氧化酶及抗氧化物质的改变。在NaCl胁迫下，施加茉莉酸甲酯后紫花苜蓿叶片的超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶活性与单独施用NaCl处理的植株相比有所提高。在正常情况下，植物细胞中的自由基会保持平衡状态，即产生自由基的部分和被清除的部分处于动态平衡状态。当植株遭遇逆境时，这种平衡会被打破，导致自由基平衡被打破，并造成大量累积，从而影响植株正常生长。此时，抗氧化酶系统中的超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等将发挥重要的保护植物体免受活性氧自由基伤害的作用[20]。茉莉酸甲酯在一定程度上可通过调节抗氧化系统来改变NaCl胁迫对紫花苜蓿造成的伤害。

本试验发现：与不施用外源物质对照处理相比，单独施用茉莉酸甲酯处理的植株叶片和根系的酶活性以及抗氧化物质均有所变化。在低温、高温等逆境条件下，茉莉酸甲酯可以导致体内保护酶活性升高[21-22]。紫花苜蓿体内保护酶系统在受到外来逆境刺激时会发生变化，急需进行有效的机制调节，以保护自身机体免受伤害。

综上所述，使用外源茉莉酸甲酯可有效诱导一系列抗逆系统变化，增强植物抗性。茉莉酸甲酯在调节植物生物胁迫和非生物胁迫逆境条件下的反应有相似之处，但其诱导植物抗逆的作用机理还有不明确的部分，尤其是有关分子水平的研究还有待深入。