烟草早花相关基因ELF的生物信息学分析

吴俊林 郭传滨 李 昂 姜 山 肖金胜 刘 哲 王瑞云 周权* 贾峰

（1河南省驻马店市烟草公司泌阳县分公司，河南泌阳 463700；2湖北中烟工业有限责任公司襄阳卷烟厂，湖北襄阳 441000；3河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001）

已有研究表明，植物早花在拟南芥中主要存在6种成花途径，即春化途径、自主开花途径、光周期途径、赤霉素途径、温敏途径及年龄途径[1]。低温及带来的一系列生化反应，可直接影响相关的成花基因（FT、SOC1、ELF 和 FLC），导致植物早花[2-3]。 另外，低温可活化赤霉素[4]、茉莉酸[5]等信号通路，调控成花基因表达，导致植物早花；低温还可诱导开花关键基因SOC1表达水平升高，导致植物早花[6]。

烟草早花是指烟株在未达到本品种特性或当地常年栽培应有的高度和叶片数时就提前现蕾开花的现象。环境低温作为影响烟草早花的非生物胁迫之一，移栽后若出现13～18℃的低温并持续1周左右，即可诱导烟草早期开花基因的表达[6-7]。早期开花基因4（ELF4）被认为是光周期感知和昼夜节律调节的必需基因[8]，DhEFL4可能在花期调控中发挥重要作用。ELF4基因是生物钟反馈回路的重要组成部分，失去该基因会导致严重的时钟损伤，植株在非诱导光周期下开花早[9]。ELF4在不同器官类型的时间表达存在差异，MeELF4在木薯的根、茎和花中表现为低表达[10]，DhEFL4基因在营养器官和生殖器官均有表达[8]。早期开花基因3（ELF3）在拟南芥中是光周期开花和正常昼夜节律调节所必需的基因，可能具有转录调控功能[11]，引起拟南芥早花[12]。但是，在拟南芥和水稻中，基因AtELF3和OsELF3.1的调控作用是相反的[13]。蛋白ELF3是构成ELF4和LUX之间复合物的必要和充分条件，该复合物在白天被调节，在黄昏达到顶峰[14]。此外，蛋白ELF3和ELF4还与染色质重构因子、组蛋白去乙酰化酶、转录因子等其他蛋白形成多种复合物，从而实现多种靶点的转录抑制[15]。拟南芥的蛋白ELF3和ELF4是2个重要的信号枢纽，它们整合了环境光和温度信号，调控植物的开花[16-17]。

烟草作为重要的经济作物和模式作物之一，早花现象容易导致烟株叶片数量减少，也会降低烟叶的品质，从而影响烟农的最终经济收入。目前，对普通烟草早花相关基因ELF表达及其蛋白特性的研究尚少。本研究通过生物信息学对烟草早花基因及其蛋白理化特性进行预测和分析，旨在为预防烟叶早花领域研究奠定基础，为降低早花发生对烟叶产量和质量的影响提供依据。

1 材料与方法

1.1 数据的获取

分别在 NCBI 数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、拟南芥数据库（http：//www.arabidopsis.org/,V10.0）、茄科数据库（https：//solgenomics.net/）和烟草数据库（http：//nadh.ice.mpg.de/NaDH/）下载水稻、拟南芥、辣椒、番茄和烟草中与早花（early flowering）相关基因的DNA序列，利用ExPASy在线软件（https：//web.expasy.org/translate/）Translate tool将 DNA 序 列翻译成蛋白质序列，选取Open reading frames比较长和相对集中的翻译序列。

1.2 早花相关蛋白质理化性质分析

采用 ExPASy在线软件 ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）对获得的早花相关蛋白序列的等电点、分子量和脂肪族氨基酸指数等理化性质进行分析[18]。SignalP 网站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）用于对烟草早花相关蛋白的信号肽进行分 析 ，TMHMM 网 站 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）用于对烟草早花相关蛋白的跨膜螺旋结构进行预测。

1.3 多序列比对与系统进化树构建

利用MEGA 6.0软件将烟草、番茄、辣椒、拟南芥和水稻早花相关蛋白质序列进行多序列比对（http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/），根据比对结果，采用Clustal Omega中的ClustalW模式构建系统进化树。

1.4 早花相关蛋白质结构预测分析

利用 MEME在线软件（https：//meme-suite.org/meme/）预测早花相关蛋白的motif结构域，预测基序数量为10个，其他参数设置为默认值，分析其保守序列。 利用 ExPASy ProtScale（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）预测早花相关蛋白的疏水性。利用SOPMA网站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISSMODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）预测蛋白质二级和三级结构。

1.5 早花相关蛋白质磷酸化位点的分析

利用 NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Net Phos/）在线分析早花相关蛋白中的磷酸化位点，包括丝氨酸（serine）、苏氨酸（threonine）和酪氨酸（tyrosine）。

1.6 烟草早花相关基因的组织表达差异分析

利用烟草数据库中的Expression中的Gene expression（http：//nadh.ice.mpg.de/NaDH/chart/expressi on_genes）网上分析工具，将9条烟草中早花相关基因的名称输入，进行表达分析，并将得到的组织表达图转化成矩阵模式。

1.7 数据统计

所有试验结果均重复测定2～4次，测得的结果取平均值。试验设计及计算分析采用Excel 2010和PASW Statistics 18.0软件进行，制作图表应用Excel 2010软件进行，各水平处理之间进行差异显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 早花相关蛋白质理化性质和蛋白质二级结构分析

由表1可以看出，在26个早花相关的蛋白序列中，氨基酸数目变化范围为105～1 664个，其中9条烟草早花相关蛋白的氨基酸数目最少，平均121个，而拟南芥和水稻的早花相关蛋白氨基酸数目较多。比对的26条蛋白序列中的氨基酸数量差异较大，其分子质量变化范围也较大，为12～191 kD；9条烟草早花相关蛋白质的理论等电点（pI）值，6条为酸性，3条为碱性。GRAVY预测数据显示烟草的早花相关蛋白为亲水性蛋白。此外，利用在线预测网站SignalP和TMHMM预测早花相关蛋白为亲水性蛋白。SignalP和TMHMM预测结果显示，26条蛋白中除辣椒中有2条蛋白（CaELF31和CaELF41）有信号肽的可能性较大以外，其余的蛋白具有信号肽的可能性均较小。9条烟草早花相关的蛋白质均无跨膜结构，而水稻和拟南芥的早花相关蛋白具有跨膜结构；烟草早花相关蛋白无跨膜结构域和信号肽序列，可能为非分泌性膜外蛋白。

表1 烟草早花相关基因及蛋白理化性质和蛋白质二级结构预测

从烟草早花相关蛋白的二级结构预测结果可以看出，烟草、番茄、辣椒、拟南芥和水稻早花相关蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲组成，但是在它们的二级结构中所占的比例差异较大，烟草中α-螺旋和无规则卷曲的平均比例分别为61.82%和28.94%，番茄中早花相关蛋白α-螺旋和无规则卷曲的平均比例分别为19.38%和65.93%，辣椒中早花相关蛋白α-螺旋和无规则卷曲的平均比例分别为37.89%和52.12%，拟南芥和水稻中早花相关蛋白α-螺旋和无规则卷曲的平均比例分别为43.62%和36.93%。

2.2 早花相关蛋白系统进化树分析

将烟草、拟南芥、番茄、辣椒及水稻共26个早花相关蛋白质序列进行多序列比对，利用MEGA构建系统进化树（图1）。结果表明，序列构建系统进化树主要分为2枝，一枝为番茄早花相关蛋白质（4条）和辣椒早花相关蛋白质（4条）；另一枝为烟草早花相关蛋白质（9条）、辣椒早花相关蛋白质（3条）、拟南芥早花相关蛋白质（3条）、水稻早花相关蛋白质（2条）和番茄早花相关蛋白质（1条）。值得注意的是，烟草和辣椒中早花相关蛋白质分类关系较近。

2.3 早花相关蛋白三级结构预测、多序列比对与保守结构域motifs分析

烟草和番茄早花相关蛋白三级结构预测、多序列比对和蛋白序列保守基序预测分析的结果如图2所示。可以看出，NtELF41由3条α-螺旋组成，其余8条早花相关蛋白的结构域由SH-box形成的β-转角连接2个α-螺旋组成；9条烟草早花相关蛋白都含有2个保守基序（motif1和motif2），其中8条蛋白中含有 3个基序（motif1、motif2和 motif9），基序排列的位置基本一致，motif1的保守序列为VQSVLDR。5条番茄早花相关蛋白中，4条的基序类型（motif2、motif3、motif4、motif7 和 motif10）和排列位置（motif3-motif4-motif3-motif7-motif10-motif2）比较接近，其中蛋白SolyEFL51仅含有1个与其他均不同的基序。由此表明，9条烟草的早花相关蛋白可能同源；5条番茄的早花相关蛋白中4条可能是同源，而其中蛋白SolyEFL51可能与这些均不同源。

2.4 早花相关蛋白磷酸化位点预测分析

蛋白质磷酸化是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导过程中起重要作用。烟草中9条早花相关蛋白磷酸化位点预测结果显示：9条蛋白都具有可能的磷酸化位点，但数量有差异，其中蛋白NtELF42、NtELF43、NtELF44 和 NtELF46 具有的磷酸化位点较多，可能在植物开花过程中起到了信号转导的作用，从而实现了DNA复制和花芽组织分化等调控功能。

2.5 烟草早花相关基因的组织表达差异分析

烟草早花相关基因在植株组织表达的结果显示，基因NtEFL41和NtEFL42在根、茎、花冠、种子、花药及花梗等组织中均有表达，其中NtEFL41在根、茎以及种子中高表达，NtEFL42和NtEFL44在花及花梗中较高表达，NtEFL43主要在叶中高表达；NtEFL45、NtEFL46、NtEFL47、NtEFL48 和 NtEFL49 在所有组织中均不表达。由此表明，不同的早花基因在不同的组织中表达差异明显，具有组织特异性，暗示了这些基因参与了不同组织的生长发育阶段。

2021年由于前期的持续低温，河南泌阳大田出现了烟草早花。6月4日摘去大田早花烟株顶端花序，6月22日对打顶烟株和未打顶烟株的农艺性状调查结果表明，虽然二者之间的株高和茎周长差异极显著（P<0.01），最大叶长之间差异显著（P<0.05），但是烟叶的数量、最大叶宽、长宽比及叶面积之间差异不显著。烟叶成熟后期，早花打顶与未早花的烟株之间已经差异不显著。实践结果表明，若烟草发生早花，应尽快打顶处理，并促进烟株在团棵期后的生长，可有效降低早花对烟草后期生长发育的影响。

3 结论

9条烟草早花相关的ELF蛋白质均无跨膜结构和信号肽序列，为亲水性非分泌蛋白，且属于膜外蛋白。普通烟草ELF蛋白二级结构中α-螺旋的比例很高 （61.82%），除蛋白NtELF41由3条α-螺旋组成外，其余8条早花相关蛋白的结构域主要由SH-box形成的β-转角连接2个α-螺旋组成。烟草ELF基因在进化过程中保守性相对较强，结构变化不大，与辣椒植物同源关系较近。蛋白NtELF42、NtELF43、NtELF44和NtELF46具有的磷酸化位点较多，推测在开花过程中可能具有信号转导的作用。烟草ELF基因具有组织表达特异性，暗示了这些蛋白参与了不同组织的生长发育阶段。