体外膜肺氧合全血离体灌注边缘性供肝功能的实验研究

季学闻，马利兵，若巴提·艾尔肯，肉斯太木江·依马木，赵晋明

（新疆医科大学第一附属医院肝脏·腹腔镜外科，乌鲁木齐 830054）

心脏性死亡器官捐献(Donation after cardiac death,DCD)供体在心脏停跳过程中，其肝脏会经历低血压、休克、缺氧等热缺血损伤，导致供肝的质量和功能异常，成为边缘性供肝（Marginal donor liver），其利用率在美国仅为2%～14%，造成的主要原因是热缺血时间过长[1]。体外膜肺氧合技术（Extracorporeal membrane oxygenation, ECMO）可将血液从体内引到体外，经膜肺氧合再用泵将血灌入体内，实现在心脏停跳后即刻提供稳定的自体血流灌注和充分的氧供，可进行长时间心肺支持，有效减少器官热缺血时间[2]。研究表明，对心脏性死亡器官捐献供体进行ECMO 在体常温灌注，使器官获取和使用率均明显提高，肝移植术后受体1 年生存率达80%～90%，移植肝和受体的存活率与同期接受标准化脑死亡器官捐献（Donation after brain death，DBD）供体的存活率相当[3]。本实验探讨体外ECMO技术对提高边缘性供肝功能的可行性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料与分组选择健康比格犬6 只，体重11～13 kg，雌雄不限，由新疆医科大学第一附属医院动物中心提供。所有动物实验遵从动物福利，实验方案通过实验动物伦理委员会审查（IACUC-20160218-018）。将实验犬编为1～6 号，按数字表法随机分为实验组和对照组，各3 只。HE 染色用肿瘤坏死因子（TNF-α）试剂盒（美国Biovision 公司）。体外循环机及配套ECMO 套包（德国STOCKO 公司，STOCKERT Instr.MunichⅡ型）。

1.2 方法所有动物实验前禁食、禁水6 h，腹腔注射2.5%戊巴比妥钠（1.0 mL/kg）。麻醉成功后，两组全身肝素化，取腹部大十字切口，游离腹主动脉腹腔段和肝动脉及门静脉，完整取出肝脏，常温下离体热缺血20 min，对照组犬肝脏采用800 mL，0～4℃组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐（HTK）器官保存液灌注并冷保存2 h；实验组犬肝脏采用ECMO 转流，常温下全血离体连续灌注2 h，用800 mL 0～4℃HTK器官保存液灌注并冷保存2 h。ECMO 管路在实验组热缺血期按静脉-动脉（V-A）ECMO 辅助安装方式：即经肝动脉和门静脉插管建立ECMO输出管，肝下下腔静脉插管建立ECMO 输入管，插管型号根据犬血管直径而定；离体辅助灌注期间流量范围在40～220 mL·kg-1·min-1，静脉血氧饱和度维持在65%以上，ECMO 管路浸入水温为37℃的恒温箱中。抗凝血策略：持续静脉泵入肝素，维持激活全血凝固时间（ACT）180～220 s，观察ECMO环路血栓情况。收集两组犬全身血液用于EC⁃MO的全血体外转流。

1.3 观察指标

1.3.1 HE 染色的组织学特征 取两组犬肝组织用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，苏木精-伊红染色，4 μm 切片，光学显微镜下观察。采用改良Suzuki评分标准评估两组犬肝组织缺血再灌注损伤的严重程度（充血、空泡化、细胞浸润和坏死）[4]。

1.3.2 透射电镜下的组织学特征两组犬肝组织环氧树脂包埋，70 nm 切片，饱和醋酸铀、构椽酸铅双重染色，透射电镜观察两组犬肝细胞核、线粒体及内质网超微结构的变化，放大倍数为24 000倍。

1.3.3 肝组织内TNF-α 表达的H-Score 评分两组犬肝组织标本用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，常规5 μm连续切片，用免疫组化SABC 法，加入PBS，按1∶100配好的一抗（Bioss 公司的兔抗肿瘤坏死因子），置于湿盒内4℃孵育过夜。PBS（pH 7.4）洗涤3 次，每次5 min。加入二抗（Servicebio公司HRP标记的山羊抗兔IgG），室温孵育50 min，DAB显色液和苏木素染色，脱水封片。采用Pannoramic MIDI 数字切片扫描仪（匈牙利，3D HISTECH 公司）扫描，Pannoramic viewer 软件放大20 倍后进行观察并截取图片。Quant center densito quant 分析软件自动识别染色强度，将图中深棕色判定为（+++），计为3 分，棕黄色判定为（++），计为2 分，浅黄色为（+），计为1 分，蓝色细胞核为（－），计为0 分。根据公式[H-Score =∑pi(i+1)=（1×弱染色%）+（2×中度染色%）+（3×强染色%）]（式中pi 表示阳性细胞数量占切片中所有细胞数量的百分数；i 代表着色强度），计算H-Score 评分。H-Score 为0～300分，评分越高说明综合阳性强度越强。

1.4 统计学处理采用SPSS 24.0统计软件进行分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组犬肝组织HE 染色结果两组犬正常肝组织HE 染色结果显示，肝小叶结构完整，未见明显坏死、空泡化、充血及炎症反应等（图1-a、1-b）。常温下犬肝热缺血20 min 后，两组肝组织HE 染色结果显示，肝小叶结构大致完整，大量肝细胞肿胀，胞质疏松淡染，肝窦及汇管区可见大量出血，未见明显坏死、空泡化及炎症反应等（图1-c、1-d）。实验组犬肝组织经离体ECMO 全血灌注2 h 及HTK 器官保存液冷保存2 h 后，其肝小叶大概结构完整，肝细胞肿胀较多，且部分肝细胞空泡化，但无明显充血及炎症反应等（图1-e）。对照组犬肝组织经HTK 冷保存2 h 后，肝小叶结构不完整，大量肝细胞胞质内可见大量圆形空泡，肝窦扩张广泛（图1-f）。

图1 两组犬肝组织HE染色结果（×40）

2.2 两组犬肝组织透射电镜下染色结果两组犬正常肝细胞核（N）呈卵圆形大而饱满，核仁（Nu）较大，常染色质着色浅，细胞核孔清晰可见。细胞质内可见丰富的线粒体（M）、粗面内质网（RER）及糖原（GL）颗粒（图2-a、2-b）。常温下犬肝热缺血20 min 后，两组电镜下可见肝细胞核形态饱满，但核仁消失。线粒体数量明显减少且体积缩小；粗面内质网上的核糖体减少（图2-c、2-d）。实验组犬肝组织经离体ECMO全血灌注2 h 及HTK 器官保存液冷保存2 h 后，电镜下可见细胞核呈圆形大而饱满，核仁明显；线粒体丰富，分布均匀且形状规则；粗面内质网丰富，未见明显脱颗粒；胞质内糖原丰富，未发生明显病变（图2-e）。对照组犬肝组织经HTK 冷保存2 h 后，电镜下肝细胞核异形，核仁消失；线粒体形状不规则，嵴略模糊部分嵴消失；粗面内质网有脱颗粒发生及灶性溶解发生（图2-f）。

图2 两组犬肝组织透射电镜下染色结果（×24 000）

2.3 两组犬肝组织内TNF-α 的H-Score 评分结果比较实验组犬经离体ECMO 全血灌注2 h 后肝组织中TNF-α 表达的H-Score 评分高于灌注前（P<0.05）；经HTK冷保存2 h后，实验组犬肝组织中TNF-α表达的H-Score 评分显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。对照组经HTK 冷保存2 h 后，犬肝组织中TNF-α 表达的H-Score 评分显著高于正常肝组织和热缺血20 min 后，差异均有统计学意义（P<0.05）（表1）。

表1 犬肝组织内TNF-α表达的H-Score评分（±s，分）

表1 犬肝组织内TNF-α表达的H-Score评分（±s，分）

分组正常肝组织热缺血20 min后HTK冷保存2 h后实验组（n=3）对照组（n=3）ECMO全血离体灌注灌注前134.59±10.20灌注2 h后141.02±12.67 tP 130.12±10.97 131.30±9.53 0.207 0.356 133.79±8.65 132.89±10.96 0.315 0.729 138.15±12.16 162.90±11.81 8.512 0.002

3 讨论

目前，如何改善和提高边缘性供肝功能，已成为国内外研究热点[2,5]。一些肝移植中心已通过将EC⁃MO 安装在心脏性死亡器官捐献供体体内转流而获得满意疗效。肾脏转运器（Life Port）已成功用于离体供肾的长途转运和抢救性治疗，受此启发，一些肝移植学者提出能否将ECMO 用于已离体的边缘性供肝的维护和复转[6-8]。本实验采用ECMO 体外转流和全血灌注技术，探讨其在提高离体的边缘性供肝功能中的可行性及价值，为延长供肝的保存时间和保证长途转运的安全性提供参考。

缺血损伤是原发性移植肝功能障碍的一个主要因素。热缺血和冷缺血时间延长是导致肝脏保存损伤的主要原因。对于心脏死亡器官捐献供体，在获取供肝前，其全身情况较差，供肝往往处于较长时间且隐匿的低灌状态。理论上，离体供肝的热缺血时间一般不宜超过5 min，冷缺血时间不宜超过14 h，否则将加重肝脏损伤，导致移植术后恢复时间延长、胆管狭窄和移植肝存活率下降[9-11]。基于此，本实验采用ECMO体外转流和全血灌注技术，使供肝重新获得持续而有效的血流及必要的营养素和氧气。结果显示，与对照组相比，实验组犬肝组织内小叶形态结构更完整，肝细胞变性、坏死更少；在超微结构显示肝细胞核及胞浆内的线粒体、粗面内质网等细胞器的形态和数量更丰富；组织间隙的炎症因子水平（TNFα）也更低，初步说明该技术在维护肝小叶结构及细胞形态的完整性，减轻热缺血及缺氧性损伤，以及促进边缘性供肝功能的修复是可行而有价值的。

综上所述，ECMO 全血离体灌注在一定程度上能改善边缘性供肝的功能，如何更好地应用于临床还值得深入研究。