基于液质联用技术的柴胡化学成分研究*

孙 秋，王文姌，张洪财，周 鹏

（黑龙江中医药大学a.附属第一医院；b.中医药研究院；c.继续教育学院，黑龙江 哈尔滨150040）

柴胡（Bupleuri Radix）是中医常用的药物。其味苦凉、性微寒，最早出自《神农本草经》，列为上品，具有解表和里、疏肝解郁、升举阳气之功效，用于治疗肝郁气滞、子宫脱垂、月经不调、胸胁胀痛。2020 版《中国药典》伞形科植物柴胡Bulpeurum chinese DC.和狭叶柴胡Bulpeurum scorzoneri folium Willd.的干燥根。按照性状，分别称为“北柴胡”和“南柴胡”[1]。柴胡的应用已有2000 多年的历史，是治疗少阳证的首选要药。

化学成分研究发现，柴胡中主要含有挥发油、黄酮、有机酸、皂苷及甾醇类[2-5]。药理学研究证明，柴胡具有解热、镇痛、镇咳、抗炎抗菌、增强免疫力、抗病毒、抗肿瘤等作用[6-9]。

1 实验部分

1.1 试剂、药物及仪器

色谱级甲酸（批号：202012 北京DIKMA 公司）；乙腈（批号：20201108 北京DIKMA 公司）；蒸馏水（批号：20210510H 广州屈臣氏食品有限公司）；柴胡皂苷A（批号：DST200509-006 成都德思特生物技术有限公司）；柴胡皂苷D（批号：DST201015-011 成都德思特生物技术有限公司）。

柴胡购于北京同仁堂哈尔滨分公司（批号：181204），经黑龙江中医药大学生药学教研室鉴定为正品北柴胡。

ACQUITYTM 超高效液相色谱仪（美国waters公司）；AB SCIEX-5600 型质谱仪（美国AB 公司）；ME204T 型分析天平（梅特勒-托利多精密仪器有限公司）；FDU1200 型冷冻干燥机（东京理化器械株式会社）。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱、质谱条件

色谱条件 流动相1%甲酸水（A）-乙腈（B）洗脱程序见表1；体积流量0.3mL·min-1；柱温40℃；进样量5μL。

表1 色谱梯度洗脱条件Tab.1 Chromatographic gradient elution conditions

质谱条件 采用电喷雾式离子源，采用全扫描质谱和二级质谱正负离子分别经行全扫描，扫描范围是100～2000m/z；干燥气体积流量8L·min-1，干燥气温度450℃，雾化气体：N2。碰撞气体：He。雾气化压70kPa。毛细管电压：正离子模式4kV、负离子模式2kV，碎裂电压200V。

1.2.2 供试品溶液的制备

柴胡溶液制备 称取柴胡饮片10g，粉碎后用水煎煮3 次，每次1h，浓缩冻干，将冻干粉末2g 用乙醇溶解，离心5000r·min-1，得到柴胡供试品，并用0.45μm 微孔滤膜滤过，即得滤液，待测。

对照品溶液的制备 柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍药苷、芍药内酯对照品各2.00mg，将各个样品置于10mL 的容量瓶内加入一定量的乙醇超声，溶解后加入乙醇定容到刻度线。进样前取对照品溶液用乙醇稀释至10 倍，并用0.45μm 微孔滤膜滤过，得滤液，待测。

1.2.3 化学成分数据库的建立 借助CNKI 等数据库检索相关的柴胡的文献，全面搜集中药柴胡所含的化合物的分子式、分子量、相关化学名称等相关信息，建立信息数据库。借助Chemspider 网络数据库信息，计算负离子模式如[M-H]-，以及正离子模式如[M+NH4]+、[M+H]+等多种离子形态下的质荷比数值。1.2.4 分析的软件应用 将柴胡原始质谱数据导入PeakView2.2 软件中，将总离子流图提取出一级质量数与其mol 文件所对应的信息进行的匹配，同时与标准品的碎片信息进行了对比。质量数误差5ppm以内、结构匹配度达到80%以上，对化学成分进行鉴定。

2 结果与讨论

2.1 化合物鉴定[10-15]

利用UPLC-Q-TOF-MS 方法，采集正离子和负离子模式下的柴胡水煎液总离子流图，见图1。

图1 柴胡水煎液离子流图Fig.1 Ion flow diagram of Bupleurum decoction

通过对每个离子流峰分析，得出其质谱裂解规律，参考相关文献，以及数据库，共鉴定出15 个化合物，结果见表2。

表2 化合物鉴定结果Tab.2 Compound identification results

图2 柴胡皂苷a 离子流图Fig.2 Saikosaponin a ion chromatogram

图3 柴胡皂苷d 离子流图Fig.3 Saikosaponin d ion chromatogram

2.2 裂解分析

柴胡皂苷a 准分子离子峰[M-H]-m/z 779，碎片离子m/z 617 脱去个六碳糖，m/z 473，脱去五碳糖。与标准品对比后出峰时间相同。柴胡皂苷d 与柴胡皂苷a 相同，可鉴别出来[10]。柴胡皂苷a 见图4～6。柴胡皂苷d 见图7～9。

图4 柴胡皂苷a 裂解过程Fig.4 Saikosaponin a cracking process

图5 水煎液柴胡皂苷a 二级质谱信息Fig.5 Decoction Saikosaponin a MS information

图6 柴胡皂苷a 二级质谱信息Fig.6 Saikosaponin a MS information

图7 柴胡皂苷d 裂解过程Fig.7 Saikosaponin d lysis process

图8 水煎液柴胡皂苷d 二级质谱信息Fig.8 Decoction Saikosaponin d MS information

图9 柴胡皂苷d 二级质谱信息Fig.9 Saikosaponin d MS information

3 结论

应用UPLC-Q-TOF-MS 技术，能够准确快速的进行分析，具有高灵敏度、高分辨率的优点，可以解决中药化学成分多样性与复杂性对研究带来的困难，可以使中药化学成分的分析周期缩短，节约实验成本。

柴胡中化学成分复杂，为得到分离度更好的色谱峰，对分析条件进行优化。考察了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水两种不同的流动相系统，结果显示，乙腈-水的洗脱效果更优，故流动相采用乙腈和0.1%甲酸水。本研究利用UPLC-Q/ TOF-MS 技术分析了柴胡药材的水煎液中的化学成分，根据准分子离子峰的保留时间、相对分子质量、二级碎片等信息，并结合裂解规律，与对照品在相同质谱条件下进行比对，从柴胡提取物中共鉴定出15 种化合物。本实验通过对柴胡的化学成分分析，为柴胡质量控制研究提供了理论基础。