TGF-β1、MMP-9、VEGF在输卵管妊娠中的表达和意义

金力荣，杨麦青，徐洪波，魏燕妮

（1.昌邑市人民医院产科，山东 昌邑 261300；2.昌邑市人民医院病理科，山东 昌邑 261300；3.潍坊市人民医院病理科，山东 潍坊 261041；4.昌邑市人民医院输血科，山东 昌邑 261300；5.潍坊护理职业学院健康管理系，山东 潍坊 261041）

输卵管妊娠（tubal pregnancy）是异位妊娠中最常见的一种，是妇产科最为常见的急腹症[1]。输卵管妊娠在早期未破裂时，诊断难度较大，若不经及时早期的诊断和治疗，严重者会因失血致死[2，3]。现阶段诊断异位妊娠的方法是通过一系列彩超和持续监测血清β-hCG 的水平，但这些指标都不具有特异性，因此探索新的特异性的标记物用以早期、及时诊断输卵管妊娠具有重要意义。正常妊娠是一个非常复杂的过程，滋养叶细胞的受控侵袭、免疫细胞和细胞因子的平衡以及滋养叶细胞和免疫细胞之间的影响都起着重要的作用。TGF-β1 位于人染色体19q13.1-q13.3，是一种多功能细胞因子，可以调节免疫细胞生长、分化，影响细胞外基质的形成，维持免疫功能和免疫稳态，促进胚胎发育等[4-7]。以往研究表明[8，9]，TGF-β1 参与调解妊娠过程中母体免疫耐受的过程。TGF-β1 水平的改变参与了妊娠期相关疾病的发生发展，如自然流产、胎盘植入[10，11]。正常的血供和氧供对于维持正常的妊娠也是必不可少的。VEGF 在促进血管生成、调节细胞耐受低氧水平的过程中意义重大[12-14]。基质金属蛋白酶（MMPs）是一组蛋白水解酶，能够降解细胞外基质，MMPs 在妊娠过程中可以水解细胞外基质，从而调节滋养叶细胞的浸润功能[15-17]。本实验综合以上研究结论，通过研究TGF-β1、MMP-9、VEGF 在输卵管妊娠患者绒毛组织中的表达水平，及其与临床指标的关系，以期明确TGF-β1、MMP-9、VEGF 在输卵管妊娠发生发展过程中可能的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017 年1 月-2020 年12 月于昌邑市人民医院妇产科就诊并经过临床诊断且手术治疗的输卵管妊娠患者40 例作为观察组，所有患者术前未经任何治疗，临床和病理资料保存相对完整，另选取同期非意愿妊娠正常早孕自愿行人工流产患者40 例作为对照组。两组年龄、停经天数、孕次、体质指数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。本研究已经医院伦理委员会审批通过，所有研究对象均知情并签署同意书。

表1 两组一般资料比较（±s）

表1 两组一般资料比较（±s）

1.2 纳入和排除标准 纳入标准：①所有患者术前由2 名妇产科医师结合彩超明确诊断；②均为自然受孕；③个人资料完整；④血常规、凝血功能正常；⑤血糖、血压正常。排除标准：①认知、精神功能障碍；②合并遗传疾病；③合并恶性肿瘤。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 经手术切除的输卵管妊娠标本放入10%的中性福尔马林固定12 h，经人工流产术后的新鲜绒毛组织用0.9%氯化钠注射液冲洗去掉过多的血凝块，然后用10%的中性福尔马林固定12 h。常规取材后经脱水、透明行HE 染色。

1.3.2 免疫组织化学染色 TGF-β1、MMP-9、VEGF兔抗人单克隆抗体（工作液浓度1∶100）购买于武汉三鹰生物科技有限公司。所有绒毛组织标本均经2位病理医师独立诊断。取3～4 μm 切片，免疫组织组织化学方法采用SP 法，具体步骤包括：烤箱烤片、脱蜡、脱水；柠檬酸修复，羊血清孵育；滴加一抗（TGF-β1、MMP-9、VEGF）；滴加生物素标记的二抗抗体；加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶；滴加DAB 显色液观察显色。染色滴加一抗时用PBS 液替代一抗当做阴性对照。

1.4 结果判读 依据美国临床肿瘤学会ASCO 分级分别对TGF-β1、MMP-9、VEGF 的染色进行判读。染色阳性的细胞面积＜5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%，依次记为0、1、2、3、4 分。细胞着色强度标记-、+、++、+++，依次记为0、1、2、3 分。将染色阳性的细胞面积评分和细胞着色强度评分相乘，＜4 分为低表达，≥4 分为高表达。

1.5 观察指标 比较两组绒毛组织中TGF-β1、MMP-9、VEGF 的表达水平，分析观察组绒毛组织中TGF-β1、MMP-9、VEGF 表达与临床指标的关系，探讨TGF-β1与MMP-9、VEGF 的关系。

1.6 统计学处理 采用统计分析软件SPSS 19.0 对本实验数据进行分析。计量资料以（±s）表示，组间比较行t检验；计数资料以[n（%）]表示，组间比较行χ2检验；相关关系采用Pearson 相关性分析；P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组TGF-β1、MMP-9、VEGF 表达比较 观察组TGF-β1、VEGF 蛋白表达低于对照组，MMP-9蛋白表达高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组TGF-β1、MMP-9、VEGF 表达比较[n（%）]

2.2 观察组TGF-β1、MMP-9、VEGF 的表达与临床指标的关系 观察组绒毛组织中TGF-β1、MMP-9、VEGF 的表达水平与年龄、停经天数、孕次、体质指数无关（P＞0.05），见表3。

表3 观察组TGF-β1、MMP-9、VEGF 的表达与临床指标的关系

2.3 观察组TGF-β1 的表达与MMP-9、VEGF 表达的关系 观察组TGF-β1 的表达与VEGF 呈正相关（r=0.326，P＜0.05），与MMP-9 的表达呈负相关（r=-0.353，P＜0.05），见表4、图1。

图1 TGF-β1 与VEGF、MMP-9 的相关性

表4 观察组TGF-β1 表达与MMP-9、VEGF 表达的关系

3 讨论

输卵管妊娠是最常见的异位妊娠，以壶腹部妊娠最多见[3，18]。输卵管妊娠未破裂时，临床症状不典型，较难诊断，若不及时诊断和早期治疗，严重者可危及生命。目前临床采用输卵管切除术和/或保守治疗，手术切除会影响患者的再次妊娠，保守治疗可能会再次导致输卵管妊娠[19，20]。各治疗效果都存在差异，因此探索新的用于指导诊断和治疗的生物标志物对于改善患者预后意义重大。

在胚胎植入过程中，胚囊和子宫内膜的同步增殖和发育是建立妊娠的重要因素。成功的植入过程还需要调节母体对胚胎的免疫系统，增加植入部位的血管生成，以及基质细胞的蜕膜化，滋养叶细胞的受控侵袭等。一些生长因子/细胞因子及其受体的增加意味着这些因子在植入调节中的关键作用。这一过程中可能涉及的因素之一是TGF-β[21，22]。TGF-β1是TGF-β 亚型中最具代表性的一种，在对促进血管的形成、调节细胞增殖分化、调节免疫稳态等有重要作用[9-11]。TGF-β1 在早期自然流产和胎盘植入等妊娠相关疾病中出现异常表达[10，11]，说明TGF-β1 在正常妊娠过程中起着一定的作用。本研究发现，在输卵管妊娠患者绒毛组织中TGF-β1 的表达减少，且TGF-β1 的表达与年龄、停经天数、孕次、体质指数一般临床指标无关，提示TGF-β1 参与影响输卵管妊娠的形成。

VEGF 是调节血管生成的主要因子之一。VEGF参与调控多种基因的表达，进一步促进内皮细胞增殖、促进新生血管形成、增加血管通透性[12-14]。VEGF在稽留流产患者血清中表达降低，在早期妊娠中表达降低会影响滋养叶细胞的侵袭和迁移，从而影响妊娠的正常发生[23]。有研究指出[24]，VEGF 在输卵管妊娠患者血清中异常增多，可以用于输卵管妊娠的诊断。本研究发现，VEGF 在输卵管妊娠患者绒毛组织中减少，与前述研究结果不同，可能是实验方法和选取的实验对象不同。说明VEGF 表达异常参与了输卵管妊娠的发展过程，同时，TGF-β1 与VEGF 在输卵管妊娠绒毛中的表达呈正相关，说明TGF-β1的表达与VEGF 的表达的变化有关，TGF-β1 对输卵管妊娠的影响可能与VEGF 参与的血管形成过程有关。

MMPs 是锌依赖性内肽酶家族，其中MMP-9起关键作用，MMP-9 的活化能够促进细胞外基质的降解，有助于提高妊娠过程中滋养叶细胞的侵袭功能[15，16]。TGF-β1、MMP-9 的异常表达与重度子痫的发展有关。本研究发现，MMP-9 在输卵管妊娠患者绒毛组织中增多，说明滋养叶细胞的局部侵袭能力增强，并且TGF-β1 在输卵管妊娠绒毛组织中的表达与MMP-9 的表达呈负相关，TGF-β1 对输卵管妊娠的影响与MMP-9 有关，其与MMP-9 的作用是相反的。

综上所述，TGF-β1 与VEGF 在输卵管妊娠患者绒毛组织中的表达减少，而MMP-9 的表达升高；TGF-β1 的表达与VEGF 的表达呈正相关，与MMP-9 的表达呈负相关；绒毛组织中TGF-β1、MMP-9、VEGF 蛋白表达异常可能参与了输卵管妊娠的发生。