全蛋及去蛋黄替代物摄入对代谢综合征小鼠脂代谢调控作用的比较分析

于智慧，周丽媛，朱迎春

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷 030801）

代谢综合征（Metabolic syndrome，MetS）是一种流行率较高的常见疾病[1]，由遗传和环境多种因素引起，是一组代谢紊乱性疾病的总称。常见临床症状有高血脂、肥胖症、胰岛素抵抗、慢性炎症、氧化应急、高血压和二型糖尿病等[2]。随着人民的生活水平在不断的提高，MetS的患病率在逐年上升，目前MetS已经成为典型慢性疾病的公共健康卫生问题。因此，饮食调控对于MetS的预防和治疗具有重要意义。

我国是鸡蛋的生产和消费大国，鸡蛋不仅营养丰富，而且价格低廉，是人们的日常生活中的重要营养来源。鸡蛋蛋黄所含有的胆固醇是人体内不可或缺的一种重要营养物质。主要参与细胞膜、各种激素、胆汁酸及维生素D的合成。胆固醇的含量与人体的健康状况直接相关，过高会导致动脉硬化并诱发一些综合并发症，过低易导致血管壁脆性增加，导致人体免疫力和应急能力降低[3]。在过去研究中，鸡蛋以其高胆固醇含量受到人们饮食限制，然而近些年许多国外研究表明蛋黄摄入可调控脂质代谢紊乱。研究表明，健康人群食用鸡蛋可改善血清高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）功能，增加血浆类胡萝卜素含量并维持低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）与高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）比率[4,5]。此外，Lemos等[6]研究表明健康人每日食用3枚鸡蛋可有效提高血清HDL-C含量，但对于LDL-C/HDL-C比率无显著影响。Shin等[7]研究表明，每日摄入鸡蛋能够提高MetS患者血清中HDL-C含量水平，并提高对胆固醇的运载能力。同时，在超重和肥胖成年男性中进行的研究表明，12周适度限制碳水化合物的饮食下，每日食用3个鸡蛋不会影响血浆LDL-C。较不含胆固醇的鸡蛋摄入组相比，蛋黄摄入可有效提高血浆HDL-C含量[8]。

然而，目前对于蛋黄摄入对于MetS的影响研究较少。蛋黄对MetS的作用机理不清楚。因此，探究鸡蛋蛋黄对于人体的作用和影响对于人们日常饮食具有重要的指导意义。基于以上，本实验通过高脂饲料建立MetS小鼠模型，实验周期为60 d，比较探究全蛋（EGG）摄入与去蛋黄（SUB）摄入对MetS血脂代谢的影响。同时，洛伐他汀类药物在MetS治疗中应用具有广泛的积极作用，能够改善患者血脂指标和心功能，提高整体的治疗效果，因此，本实验设置诺伐洛伐药物作为阳性对照组。在实验周期中定期测定小鼠体重、摄食，在实验末期测定主要脏器指标（心脏、肝脏、脾脏、肾脏和附睾脂肪组织），通过对血脂相关指标进行系统测定，比较EGG和SUB摄入对MetS小鼠脂代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：C57BL/6雄性小鼠40只、普通饲料（D12450B）、高脂饲料（D12492）、全蛋粉垫料购买于北京斯贝福生物技术有限公司，合格证号：NO.110324200102532878，动物许可证号：SCXK(京) 2019-0010。其中去蛋黄代替物粉（SUB）由（99%蛋清），1%的瓜尔豆胶和黄原胶，0.01%的β-胡萝卜素组成，含有0 mg的胆固醇。

主要试剂：TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT及AST、SOD、MDA检测试剂盒和总蛋白定量测定试剂盒（BCA法）购买于南京建成生物工程研究所。洛伐他汀（Lov）购买于北京万生药业有限公司。

1.2 主要仪器与设备

SRH高压均质机，上海申鹿均质机有限公司；SPectraMax i3x多功能酶标仪，美国Molecular Devices；小鼠用灌胃针12号，北京中科恒天科技有限公司；BSM电子分析天平，江苏灼卓精密仪器有限公司；BC/BD-20ZHT冷冻冰箱，青岛海尔特种电冰柜有限公司；BTP-8Z冷冻干燥机，SP Scientific公司；WFJT200可见分光光度计，尤尼柯仪器有限公司。

1.3 试验设计

实验经山西农业大学动物实验伦理委员会批准，符合动物实验伦理。选择40只C57BL/6雄性小鼠作为实验对象，体重24.5～26 g之间，饲养于山西农业大学动物科学学院小鼠屏障房内，进行一周的适应性实验。将小鼠放于层流架中喂养，采用12 h采光/12 h暗室采光循环条件，控制动物房温度21～23 ℃之间，相对湿度在40%，随机分配，分成五组，每组8只，分别为普通饲料组（ND）、高脂饲料洛伐他汀组（Lov）、高脂饲料组（HFD）、高脂饲料去蛋黄鸡蛋代替物组（SUB）、高脂饲料全蛋组（EGG）。灌胃剂量按照60 kg成年人每日食用3个鸡蛋（50 g鸡蛋干重）的剂量为0.83 mg/g，按照小鼠剂量=人的剂量×9.1换算成小鼠的剂量为7.55 mg/g。ND、HFD组每天灌胃等量生理盐水Lov组每天灌胃生理盐水0.4 mL，在实验结束前十天，变更灌胃药品，Lov的剂量为0.3 mg/g。小鼠每天自由摄食，每3 d对饲料和小鼠进行称重，计算小鼠摄食量和体重变化。

1.4 试验方法

1.4.1 样本采集

1.4.1.1 血清收集

实验结束前小鼠禁食12 h。通过摘取小鼠眼球眼眶处取血，随后脊椎脱臼法处死小鼠。血液收集于离心管中，40 ℃静止3 h后，将血样在3000 r/min，于4 ℃离心10 min，上层血清保存于-80 ℃冰箱中。

1.4.1.2 脏器收集

用棉球蘸取少许医用酒精来擦小鼠身体，切开腹腔，分别取出小鼠肝脏、肾脏、心脏脾及附睾脂肪，观察肝脏形态，将肝脏立即放置液氮中保存，并转移至-80 ℃冰箱中保存用于生化指标测定。

1.4.2 指标测定

1.4.2.1 脏器指数的测定

取小鼠肝组织、肾组织、脾组织、心脏组织以及附睾脂肪组织用生理盐水洗净，用滤纸擦干后称重，并且计算相关脏器指数[9]。

1.4.2.2 血脂及肝脂指标的测定

血清和肝脏中的高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、甘油三脂（Triglycerides，TG）和总胆固醇（Total cholesterol，TC）均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，具体操作步骤根据试剂盒说明书进行操作。

1.4.2.3 天冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase，AST）及丙氨酸转氨酶（alanine transaminase，ALT）指标的测定

血清和肝脏中的AST及ALT测定参考南京建成生物工程研究所试剂盒说明书利用分光光度法进行测定[10]。

1.4.2.4 肝脏超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）指标的测定

用分析天平准确称量0.20 g肝脏组织，按照重量体积比为1:9的比例加入事先准备好的PBS溶液（0.01 mol/L），利用组织匀浆机进行充分研磨，制备含量为10%的组织匀浆液，根据南京建成生物工程研究所试剂盒的操作步骤，分别测定肝脏组织匀浆中的MDA和SOD活力[11]。

1.4.2.5 小鼠肝脏及脂肪组织切片分析

用10%甲醛溶液固定肝脏及附睾脂肪组织后冲洗24 h，并用不同浓度梯度的乙醇脱水。二甲苯透明，浸蜡包埋后切片，厚度为5 μm，经HE染色后，在显微镜下观察组织结构。

1.5 数据处理

试验均重复三次，结果表示为：平均值±标准偏差。用Microsoft Excel 2016计算各个指标的平均值与标准差；测定结果用使用SPSS 26.0进行数据处理，p＜0.05为显著性差异，p＜0.01为极显著性差异；利用Origin 8.6进行作图分析。

2 结果与讨论

2.1 EGG及SUB对MetS小鼠摄食和体重的影响

在实验开始初期，各组小鼠摄食量均出现降低增加交替的现象，这是由于初期灌胃小鼠产生的应急反应造成的。由图1a可知，小鼠摄食量范围在1.81～3.85 g之间，HFD组摄食量显著低于ND组（p＜0.01），原因为高脂饲料为小鼠提供的能量（5.24 kcal/g）比普通饲料（3.85 kcal/g）多，进而减少小鼠的摄食量。在实验周期后10 d后，EGG和SUB组小鼠的摄食量显著低于HFD组（p＜0.05）。由图1b可知，为期60 d的饲养实验中，小鼠的体重从24.51～26.02 g增加到26.51～32.52 g，各组小鼠总体呈现稳定增长趋势。这表明高脂饮食能够引起小鼠体重异常增长，这与高脂诱导小鼠肥胖的研究一致[12]。同时HFD组小鼠体重的增加量显著高于EGG等其他组小鼠体重增加量，表明EGG比SUB能更显著抑制HFD引起小鼠体重异常增长[13]。

2.2 EGG及SUB对MetS小鼠主要脏器指数的影响

由图2a可知，ND组小鼠心脏指数最高为0.75，Lov组最低为0.62，EGG组小鼠的心脏指数显著高于HFD组（p＜0.05）。由图2b可得，HFD组小鼠肾脏指数最低为1.27，EGG组和SUB组都显著高于HFD组（p＜0.05），EGG组和SUB组的肾脏指数无显著差异（p＞0.05），实验说明，HFD能引起小鼠肾损伤，而EGG和SUB能显著改善由HFD引起肾脏指数下降的结果，对高脂饮食导致的肾损伤具有一定的修护作用[14]。

脾脏是机体内重要的淋巴器官，其指数可以反映机体的免疫能力的强弱，指数越大，则表明机体的免疫能力越强[15]。由图2c可知，EGG组显著高于HFD组和SUB组（p＜0.05），而SUB组HFD组脾脏指数无显著差异（p＞0.05），数据表明EGG组在一定程度上提高了小鼠的免疫系统抵抗能力，而SUB对于脾脏指数无明显作用效果。如图2d可得，ND组小鼠肝脏指数均显著高于高脂各组，且高脂各组间无显著差异（p＞0.05）。由图2e可知，ND组小鼠附睾脂肪指数最低为0.88，HFD组最高为3.65。EGG组和SUB组显著低于HFD组（p＜0.05），而SUB组显著高于EGG组（p＜0.05）。这与表明，EGG摄入较SUB能更加显著降低由HFD引起的机体附睾脂肪的积累。Yu等人[16]基于脂质组学分析长期食用蛋黄对高脂饮食小鼠的高脂血症的影响，发现，蛋黄摄入可显著降低肥胖小鼠腹部脂肪积累，这与本研究结果相一致。

2.3 EGG及SUB对MetS小鼠血脂及肝脂的影响

研究表明，临床诊断中，通过血脂血清学指标的检测有助于明确脂肪肝疾病诊断，对及早确诊和接受治疗，具有良好促进作用[17]，血脂中重要的指标如HDL-C、LDL-C、TC、TG与MetS等疾病的相关性已经得到证实[18]。LDL-C是胆固醇向肝外组织转运的主要载体工具，其含量与心血管疾病的发病率及病变程度相关，被认为是动脉粥样硬化的主要致病因子[19]。HDL-C主要是将胆固醇从肝外组织转运到肝脏进行代谢，由胆汁排出体外，其含量的高低与动脉粥样硬化的发生呈负相关[20]。由图3a和3b可知，HFD组LDL-C含量最高为1.13 mmol/L，ND组最低为0.54 mmol/L。EGG组和SUB组LDL-C含量显著低于HFD组（p＜0.05），为HFD的74.51%。同时，HFD显著抑制了血清中HDL-C水平，而EGG能显著改善由HFD引起的不良后果，使得血清中HDL-C上升到正常水平，而SUB对于MetS小鼠血清中HDL-C无显著作用，这与之前的研究一致[21]。Christopher等[22]研究发现，较去蛋黄鸡蛋替代物，食用全蛋可改善代谢综合征患者脂蛋白分布，表现为增加LDL-C含量及HDL粒径，增强血清HDL运载胆固醇的能力，这与本研究结果相一致。图3c和3d为血清TC和TG水平，与ND组（3.80 mmol/L）相比，HFD组（6.52 mmol/L）血清中TC含量显著升高（p＜0.05），EGG组（5.02 mmol/L）和SUB组（5.37 mmol/L）的TC含量显著低于HFD组（p＜0.05），EGG组和SUB组无显著差异（p＞0.05）。由图3d可知，EGG组TG（0.64 mmol/L）含量显著高于HFD组（0.55 mmol/L）和SUB组（0.57 mmol/L）水平（p＜0.05）。图3e和3f为肝脏TC和TG水平，EGG和SUB均可降低肝脏中TC、TG含量，SUB肝脏TC和TG含量更低，分别为0.11 mmol/L和0.42 mmol/L。Samantha等[23]表明食用全蛋可有效抑制2型糖尿病大鼠TG浓度，与酪蛋白相比，食用全蛋饮食导致大鼠血浆TG浓度降低52%。同时，Lisa等[24]研究发现，与SUB饮食相比，食用EGG可增加超重妇女胆固醇外排能力，对胆固醇代谢具有积极作用。这表明，EGG显著抑制血清和肝脏中TC水平，然而对血清TG并没有产生改善作用。

2.4 各组小鼠血清及肝脏ALT和AST水平变化

由图4a～c可知，与ND相比，HFD组血清ALT和AST水平显著升高（p＜0.05），EGG和SUB能够显著降低MetS小鼠血清AST水平。尽管EGG组ALT水平较HFD增加了0.42倍，然而EGG可显著下调AST/ALT比例。由图4d～e可知，相比于HFD组，EGG和SUB均可显著降低肝脏AST、ALT和AST/ALT比值，其中EGG组AST、ALT和AST/ALT比值分别为HFD组的44.99%、54.79%和81.74%。据有关研究证明，ALT以及AST作为评价肝功能的重要指标，ALT主要存在于肝细胞的细胞质中，而AST主要存在于肝细胞的线粒体中，受到细胞膜包被，正常情况下，ALT和AST不会在血液当中，然而，当肝脏组织发生破损或出现炎症时，细胞膜的通透性就会发生改变，会引起血清中AST和ALT水平上升。AST/ALT比值上升常见于重型肝炎、肝硬化、肝癌及酒精性肝病等肝脏疾病，AST/ALT比值随着肝脏病变的加重而逐渐升高[25]。这表明EGG和SUB对高脂饮食引起的肝脏组织破损和炎症的发生有一定的改善作用。鸡蛋蛋黄中含有丰富的卵磷脂，蛋黄中的卵磷脂具有显著的抗氧化能力，研究表明摄入蛋黄卵磷脂可有效降低肝脏中ALT及AST水平，这解释了相对于SUB，EGG更能缓解由于高脂饮食而引起的肝损伤[26]。

2.5 各组小鼠肝脏SOD和MDA水平变化

MetS常伴随着肝脏脂肪过度积累。肝脏氧化应激、肝脏脂质失调和促炎细胞因子的协同作用会导致肝脏脂肪堆积，并促进MetS发生[27]。史雅凝[28]研究表明，肝脏中包含的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）等是重要的抗氧化酶，可以作为评价人体氧化还原状态的重要指标，可作为检测MetS疾病相关的抗氧化指标。有研究发现，高脂饮食可引起肝组织SOD使机体的抗氧化损伤的防御机制受损不能清除过多的自由基而导致肝损伤[29]。由图5a可知，HFD组SOD酶活水平显著高于其他组，是ND组SOD酶活水平的1.64倍（p＜0.05），EGG组和SUB组的SOD酶活水平均显著低于HFD组（p＜0.05），分别为HFD组的75.10%和62.26%。

MDA含量是反映机体潜在抗氧化能力的重要参数，它能反映脂质过氧化速率和强度，间接反映组织过氧化损伤的程度，其含量与组织氧化程度呈正比[30]。研究发现，当肝脏组织中脂质含量过高时，会导致脂质过氧化反应加剧，使过氧化产物MDA增加，而MDA可与线粒体结合形成希夫氏碱化合物，使线粒体膜的流动性下降，干扰脂肪酸β-氧化，使脂肪在肝内积累，造成肝脏结构和功能损害[31]。由图5b可知，与HFD组相比，EGG（0.81 nmol/mg prot）和SUB组（0.63 nmol/mg prot）MDA酶活含量水平显著低于HFD组（2.03 nmol/mg prot）水平（p＜0.05），EGG组和SUB组组无显著差异（p＞0.05）。这表明，EGG和SUB都能显著抑制小鼠肝脏内过氧化，抑制机体炎症的发生，SUB对调控肝氧化作用显著高于EGG。相似的结果在之前研究中也报道过[24]。

2.6 各组小鼠病理学观察

机体中的肝脏是进行脂质代谢的主要场所，MetS常常伴随着肝脏脂质代谢系统紊乱，从而诱发肝脏脂肪过度积累，肝细胞中脂肪发生变性等肝脏疾病[32]。图6a为各组小鼠的肝脏形态，ND组小鼠肝脏颜色鲜艳红亮，表面有明亮光泽，质地较软。HFD组小鼠肝脏颜色颜色呈现红色略带黄色，质地稍微偏硬，在肝脏的表面带有脂肪颗粒，呈现病变状态，表明模型构建成功，与王宁等[33]研究结果一致。EGG组、SUB组和Lov组的肝脏表面颜色呈现红色略带黄色，其中EGG组肝脏表面略带光泽，并且没有脂肪的积累，不带有脂肪颗粒，而SUB组肝脏组织表面有轻微的脂肪颗粒，较HFD组数量较少。

观察图6b肝脏组织切片，发现ND组小鼠肝脏组织的表面结构完整清晰，肝细胞之间的界限清楚，细胞外形向周围呈现放射形态，细胞核清晰位于细胞中央，没有发现细胞炎症或细胞坏死等现象。HFD组小鼠肝细胞具有一定程度的脂肪变性，排列结构是不规则的，细胞内出现明显的脂滴溶解后的空泡且大小不一致。在EGG组和SUB组中，脂滴空泡的分布较少。实验表明EGG组和SUB能够在一定程度上抑制肝组织中脂肪的积累，并且EGG能够显著降低肝细胞中脂解空泡的形成。相关实验研究表明HFD可引起的TG储存增加会导致脂肪细胞的体积增大，脂肪细胞体积的增大是MetS主要特征[34]。观察图6c得知，ND组小鼠附睾脂肪细胞体积小、结构完整、形态清晰，HFD组小鼠附睾脂肪细胞与ND组相比，体积显著增大。EGG组、SUB组小鼠脂肪细胞大小相对于HFD组明显变小，Lov组脂肪细胞最小。实验说明，HFD能够引起肝脏组织中脂肪细胞增大，EGG和SUB摄 入都显著减小了附睾脂肪细胞体积。

3 结论

本研究建立为期60 d的MetS小鼠模型，研究EGG和SUB摄入对MetS小鼠血脂以及酶水平相关指标。EGG和SUB能缓解高脂饮食所导致的脂质代谢紊乱，主要表现在降低小鼠的体重、摄食量。EGG和SUB都显著抑制了由HFD引起的肝脏中SOD、AST、ALT以及MDA酶活上升，降低了肝脏中TC和TG的积累。相比于SUB组，EGG摄入能够显著降低血清TC和TG，LDL-C，同时显著提高血清HDL-C。组织病理学显示，与HFD组相比，EGG和SUB摄入具有减少肝脏脂肪空泡的功能，对高脂饮食引起的脂代谢紊乱有良好的预防作用。