5 ℃贮藏条件下新鲜余甘子果实褐变相关指标研究*

李 蓉，龙小妹，陈 平，范 源，3△，朱培芳

（1.云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500； 2.四川省中医药科学院转化药理与临床应用研究所，四川 成都 610041； 3.云南中医药大学第二附属医院，云南 昆明 650216）

余甘子Phyllanthus emblicaL.为大戟科叶下珠属植物，常以干燥成熟果实入药。以“菴摩勒”为药用之名，始载于《南方草木状》；以“余甘子”为药用之名，始载于《新修本草》［1］。余甘子药材主要分布于热带及亚热带地区，是印度、中国、马来西亚等国常用中药材，已有700 余年的药用历史［2］，具有抗氧化、调血脂和降血糖活性［3］，且是许多保肝配方的重要成分，还可用作抗微生物剂、抗肿瘤剂或抗炎剂［4］，并可改善金属诱导的致癌作用［5］。中医学认为，中药鲜品可保存药材的大部分活性成分，故临床应用价值高，但其在贮藏过程中可发生褐变，导致中药活性成分含量或结构改变而影响药效［6］。余甘子果实褐变会引起其感官变差及多酚和维生素C 等营养物质含量减少。多酚氧化酶（PPO）能将物质氧化成醌类，从而引发褐变［7］。目前对余甘子果实贮藏保鲜技术的探讨有限，仅对低温贮藏、涂膜、高压电场贮藏及添加酶抑制剂等措施有所研究［8］。新鲜余甘子果实中酚类化合物含量较高，没食子酸为新鲜余甘子果实褐变的底物，可作为其发生早期褐变的指标之一［9］。某些黄酮类化合物可与某些酚、醌、氨基酸或蛋白质直接聚合成褐色物质导致褐变［10］。目前对新鲜中药褐变机制的报道较少。为此，本研究中将新鲜余甘子果实置5 ℃恒温冰箱中冷藏，测定其贮藏20 d 内酚类成分含量、PPO 活性、pH、褐变指数等各项指标的变化情况，为新鲜果实类中药的贮藏和养护提供一定参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；YL-040S 型语路超声波清洗机（深圳市即洁超声科技有限公司）；D2KW-D 型电热恒温水浴锅（上海爱朗仪器有限公司）；S013 - 2100 型旋转蒸发仪（上海量壹科学仪器有限公司）；T-1000型电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）；PHS-25 型pH 计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；Neofuge 15R 型离心机（上海力申科学仪器有限公司）；SPARK 10M 型酶标仪（澳大利亚Tecan公司）。

1.2 试药

1-没食子酰基葡萄糖（1-GG）对照品（上海叶源生物科技有限公司，批号为K28J12B136898）；没食子酸（GA）对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，批号为wkq16081904）；1，3，6-O-三没食子酰基葡萄糖（TGG）对照品（武汉天植生物技术有限公司，批号为CFS201802）；鞣花酸（EA）对照品（大连美仑生物科技有限公司，批号为M0104AS）；芦丁对照品（上海叶源生物科技有限公司，批号为Y24F11Y17051），含量均不小于98%；PPO 活性检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号为20210407）；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。余甘子果实（云南省临沧市云县新鲜采摘）。

2 方法与结果

2.1 水解单宁类成分含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～5 min 时5%B，5～6 min 时5%B→15%B，6～15 min 时15%B，15～25 min 时15%B→30%B；流速：1.0 mL/ min；检测波长：270 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.1.2 溶液制备

分别取1 - GG，GA，TGG，EA 对照品2.31，2.07，0.68，2.00 mg，精密称定，置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得混合对照品溶液。取样品（去核）5 g，精密称定，加适量石英砂研磨，尽量捣碎，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定质量，加热至70 ℃回流1.5 h，称定质量，加50%甲醇补足减失的质量；45 ℃超声（功率240 W，频率40 kHz，下同）1 h，放冷，再次称定质量，加50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，用旋转蒸发仪70 ℃下蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10 mL，经0.45 μm 滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。以甲醇（分析纯）为阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

系统适用性试验：取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果理论板数按1-GG 峰计应不低于3 000；分离度均大于1.5，基线分离良好。见图1。

1.1-GG 2.GA 3.TGG 4.EAA.混合对照品溶液 B.供试品溶液 C.阴性对照品溶液图1 高效液相色谱图1.1-GG 2.GA 3.TGG 4.EAA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密吸取2.1.2项下混合对照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得1-GG，GA，TGG，EA的回归方程分别为Y1= 2 282.2X1+ 3 791.1（R2=0.999 1），Y2= 1 636.1X2+ 17.098（R2= 0.999 2），Y3=3 459.6X3+ 52.813（R2= 0.999 3），Y4= 1 951.3X4+16.8（R2=1.000 0）。结果表明，1-GG，GA，TGG，EA进样量分别在0.46～2.77 μg、0.41～2.48 μg、0.14～0.82 μg、0.40～2.40 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.1.2 项下混合对照品溶液适量，按拟订色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结 果1 - GG，GA，TGG，EA 峰 面 积 的RSD分 别 为0.64%，0.22%，0.20%，0.25%（n= 6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.1.2 项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0，2，4，6，8，10 h 时按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果1 - GG，GA，TGG，EA峰面积的RSD分别为3.02%，3.17%，3.60%，1.81%（n= 6），表明供试品溶液在室温放置10 h 内基本稳定。

重复性试验：精密称取同一批样品适量，共6份，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果1 - GG，GA，TGG，EA 含 量 的RSD分 别 为0.36%，0.53%，2.49%，0.67%（n=6），表明方法重复性良好。

2.1.4 样品中水解单宁类成分含量变化

1 - GG，GA，TGG，EA 分别在样品贮藏第15 天、第15 天、第19 天、第20 天时含量最高，在贮藏第4 天、第19 天、第18 天、第18 天时含量最低。结果显示，1 - GG及EA 在第2 天时含量增加，到第4 天含量减少，后呈曲线大幅波动；GA及TGG在前4天内含量减少，后呈曲线小幅波动。详见图2。即5 ℃条件下，样品中水解单宁类成分随贮藏时间的延长，含量总体仅小幅变化。

2.2 黄酮类成分含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～2 min 时，22%B，2～20 min 时22%B→60%B）；流速：0.8 mL/min；检测波长：327 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2 溶液制备

取芦丁对照品0.80 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得芦丁对照品溶液。取样品（去核）5 g，精密称定，加适量石英砂研磨，尽量捣碎，置具塞锥形瓶中。精密加入75%甲醇50 mL，45 ℃超声1 h，放冷，称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，浓缩，加甲醇定容至10 mL，经0.45 μm 滤膜滤过，即得供试品溶液。

A.1 - GG B.GA C.TGG D.EA图2 水解单宁类成分的含量变化A.1-GG B.GA C.TGG D.EAFig.2 Content change of hydrolyzed tannins

5.芦丁A.对照品溶液 B.供试品溶液 C.阴性对照品溶液图3 芦丁的高效液相色谱图5.RutinA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms

2.2.3 方法学考察

系统适用性试验：取上述对照品溶液、供试品溶液及2.1.2 项下阴性对照品溶液各适量，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，理论板数按芦丁峰计应不低于3 000；分离度均大于1.5，基线分离良好。详见图3。

线性关系考察：分别精密吸取2.2.2 项下芦丁对照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以芦丁进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得芦丁的回归方程为Y= 1 448X- 0.72（R2= 0.999 6）。结果表明，芦丁进样量在0.16～0.94 μg 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.2.2 项下芦丁对照品溶液适量，按2.2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果芦丁峰面积的RSD为0.28%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2.2 项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0，2，4，6，8，10 h 时按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果芦丁峰面积的RSD为3.92 %（n= 6），表明供试品溶液在室温放置10 h 内基本稳定。

重复性试验：称取同一批样品适量，精密称定，共6 份，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果芦丁含量的RSD为0.24%（n= 6），表明方法重复性良好。

2.2.4 样品中芦丁含量变化

样品中芦丁含量在第10 天达到最高，第4 天含量最低，前4天内芦丁含量逐渐下降，后呈曲线波动，整体波动幅度较小。结果表明，黄酮类成分（芦丁）在5 ℃条件下贮藏，含量变化在一定范围内。详见图4。

图4 黄酮类成分（芦丁）含量变化Fig.4 Content change of flavones（rutin）

2.3 PPO 活性测定

取样品（去核）0.1 g，精密称定，置2 mL EP管中，加1 mL 提取液，冰浴捣碎，4 ℃下、8 000g离心10 min，取上清液250 μL，于常温水浴10 min，后迅速放入沸水水浴10 min，放冷，4 ℃下、5 000g离心10 min。加入试剂一600 μL，试剂二150 μL，提取液150 μL。混匀，设置6 个复孔，每孔100 μL，磷酸盐缓冲液（PBS）封边，置96 孔板。于410 nm 波长处测定其吸光度（A），并计算PPO的活性，以反应液作对照，1 d测定1次。PPO活性计算公式，PPO=（A测定-A对照）×60/0.1。结果显示，PPO活性在第14 天时最高，第1 天时最低，整体呈曲线波动。详见图5 A。

2.4 褐变指数测定

将样品果心的中心部位横切，按横切面上果肉组织相应的褐变程度和面积来划分等级［11］。无褐变为0级，果肉褐变面积≤25%为1 级，> 25%～50%为3 级，> 50%～< 75%为3 级，≥75%为4 级，每次统计10 个果实。每次统计10 个样品。余甘子褐变指数计算公式，褐变指数= ∑（褐变级别× 级别果实数）/ 最高级别数×统计果实数（注：褐变指数为1时，可表示为完全褐变）。余甘子的褐变指数在第9 天和第10 天时达到最高，在第1天时最低，其变化呈曲线波动。但随着时间延长，褐变指数呈升高趋势，表明5 ℃贮藏条件下，样品出现了轻微褐变。详见图5 B。

A.PPO活性 B.褐变指数 C.pH图5 PPO活性、褐变指数及pH变化A.PPO activity B.Browning index C.pHFig.5 Changes of PPO activity，browning indexes and pH

2.5 pH 测定

取样品（去核）10 g，精密称定，加适量石英砂研匀，置三角瓶中，加20 mL 水，80 ℃下水浴30 min，冷却滤过，取续滤液，用pH计测定pH。pH在第10天时达最大，总体呈先上升后下降的波动趋势。详见图5 C。

3 讨论

通常认为，影响中药鲜品褐变的外界因素包括温度、湿度、贮藏时间等，中药自身的物质也会影响褐变的发生。余甘子果实所含化学成分较丰富，药理活性较多，故对其褐变进行有效抑制尤为重要。有研究表明，新鲜余甘子果实褐变多与酚类物质有关，水解单宁能在酸性、碱性条件下水解产生没食子酸、PGG 等中间产物［12-13］。没食子酸作为褐变的底物，可与PPO 反应氧化为醌和水，醌再经酶促或非酶促氧化聚合，形成褐色物质，而产生褐变［14］。新鲜余甘子果实中含有的黄酮类化合物绿原酸、芦丁在酶的催化下形成醌类物质，最终也形成不溶性的褐色多酚—— 黑色素，使其发生褐变［15］。新鲜余甘子果实的贮藏及运输，极易影响其药效及质量，但诱发其褐变的因素及机制尚未明确。

此外，新鲜余甘子果实在5 ℃下贮藏20 d 过程中，样品存在一定的个体差异，所测结果呈现的贮藏过程中与褐变相关的各指标的变化趋势较平稳。

本研究结果表明，新鲜余甘子果实在5 ℃下贮藏20 d 的过程中，酚类化合物的含量、PPO 活性和褐变指数呈曲线波动，其有效成分含量未出现明显变化，pH呈先升后降的波动趋势，表明5 ℃可作为新鲜余甘子果实的最佳贮藏条件。