磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因过量表达对集胞藻PCC6803脂肪酸合成的影响

李燕乐，钟怀荣，宣 宁，张 燕，陈 高，*，季 祥，*

(1.内蒙古科技大学 生命科学与技术学院，内蒙古自治区生物质能源化利用重点实验室，内蒙古 包头 014010； 2.山东省农业科学院 农作物种质资源研究所，山东省作物遗传改良与生态生理重点实验室，山东 济南 250100)

目前，全球对能源的利用86%以化石燃料为主。化石燃料的过度使用，加剧了环境污染。传统化石能源是不可再生的，从保护环境和能源可持续发展角度出发，寻找一种可代替传统化石能源的清洁能源迫在眉睫。与传统柴油相比，生物柴油具有良好的生物降解性，可再生等优点，在燃烧过程中还可以减少一氧化碳(CO)、二氧化碳(CO)和二氧化硫(SO)的排放。微藻具有不占用耕地、不受季节限制、适应能力强、生长周期短等优势，近年来作为生物质能源原材料受到广泛关注。

微藻作为食物链中的初级生产者，不仅可以从头合成ω-3系的超长链多不饱和脂肪酸，还具有绿色、可持续发展等优势，可以部分替代传统能源来满足世界不断增长的能源需求，在生产生物燃料中具有应用潜力。但生产成本高、产值低是限制微藻工业化发展的主要因素。自然条件下生长的微藻不足以满足工业化发展的需求，优化微藻的生长条件，对提高藻密度以及微藻脂肪酸产量等有重要意义。研究表明，微藻在胁迫条件下可以产生应激反应，微藻中脂肪酸所占比例会因某种营养成分或环境的改变而发生变化；通过改变微藻生长条件可以提高脂肪酸含量，比如：光照强度、温度以及碳氮比等。集胞藻PCC6803是微藻分子遗传学研究的重要模式生物，目前对集胞藻PCC6803代谢方面的研究已有很多成果，且已经开发出很多高附加值产品，但对微藻中长链脂肪酸的研究相对较少。利用基因代谢工程手段，在基因水平改造微藻提高中长链脂肪酸的产量，挖掘关键基因在脂肪酸合成路径中的作用具有重要意义。

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferases，PPTase)是细菌、古生菌和真核生物生长过程中的关键酶，在脂肪酸合成中起着重要作用，是一种不可或缺的催化酶。蓝藻基因组具有多个拷贝，目前己知生物中，均至少存在一个Ⅱ型PPTase。在集胞藻PCC6803中也只含有一个Ⅱ型PPTase，此Ⅱ型PPTase为Sppt和Hppt，它不仅可以催化初级代谢脂肪酸合酶中酰基载体蛋白的辅基化，而且可催化次级代谢Ⅰ型聚酮合酶中ACP的辅基化，镁离子与结合残基对PPTase的活性有很大影响，PPTase在微藻油脂代谢中的作用是将辅酶A(CoA)中的磷酸泛酰巯基乙胺基转移到酰基载体蛋白(acyl-carrier protein，ACP)的活性丝氨酸上，将无活性状态的ACP(apo-ACP)催化为有活性状态的ACP(holo-ACP)，微藻中油脂的合成途径如图1所示。在脂肪酸的代谢过程中，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶复合体(Pdh)的催化下形成乙酰辅酶A(acetyl-CoA)，其在乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACCase)的催化下形成丙二酰辅酶A(malonyl-CoA)，此时，在PPTase的催化下，将辅酶A中apo-ACP转化为holo-ACP，holo-ACP与malonyl-CoA结合，在丙二酰辅酶A酰基载体蛋白转移酶的催化下生成丙二酰ACP(malonyl-ACP)，从而启动了微藻中脂肪酸的合成。目前，PPTase基因与集胞藻PCC6803中油脂代谢之间的关系还没有报道，本研究利用同源重组平台p5ST1T2--0646UD在集胞藻PCC6803中过表达0495基因，优化藻株的生长温度及培养基中NaNO比例(即氮浓度)，来探究胁迫条件下PPTase对脂肪酸合成的影响及其在脂肪酸合成代谢中的作用。

图1 集胞藻PCC6803脂肪酸合成途径

1 材料与方法

1.1 材料

集胞藻 PCC6803为山东省农业科学院生物技术研究中心保存。大肠埃希菌感受态Trans5α和T4 DNA Ligase购自北京全式金生物技术有限公司，质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂等购自艾科瑞生物工程有限公司，限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司，混合纤维素膜(MCE膜)购自上海市新亚净化器件厂，其他所用试剂为分析纯，利用Primer 5.0软件设计引物，由北京鼎国生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

藻株在BG-11液体培养基中培养，温度为(30±2) ℃。光照强度为50 μmol·m·s，循环光照培养。

1.2.2 同源重组平台p5ST1T2--0646UD的构建

用酚氯仿抽提法提取野生型集胞藻PCC6803基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，以-0646U-F和-0646U-R为引物对扩增同源重组平台上游臂，以-0646D-F和-0646D-R为引物对扩增同源重组平台下游臂-0646D；用限制性内切酶lⅠ、Ⅰ分别双酶切-0646U质粒和p5ST1T2质粒，经T4 DNA Ligase 16 ℃过夜连接后，将连接产物转入大肠埃希菌Trans 5α转化，PCR扩增检测筛选出阳性单克隆，挑取单克隆37 ℃、180 r · min生物摇床上振荡培养，提取质粒p5ST1T2--0646U；最后，用限制性内切酶Ⅰ、Ⅱ双酶切质粒p5ST1T2--0646U和质粒-0646D，再次经T4 DNA Ligase连接、转入大肠埃希菌Trans 5α、筛选阳性单克隆、在生物摇床上振荡培养，提取质粒p5ST1T2--0646UD(以下简称0646UD)。将质粒0646UD送至山东省农业科学院生物技术中心测序中心进行测序验证。

1.2.3 同源重组质粒0495的构建

以集胞藻PCC6803基因组DNA作为模板，以Pcpc560-F和Pcpc560-R为引物对扩增启动子Pcpc560，以0495-F和0495-Flag-R为引物对扩增目的基因0495，引物序列如表1所示。用Pcpc560-F和0495-Flag-R为引物对将启动子Pcpc560片段和目的基因0495片段进行融合扩增，得到Pcpc560+0495片段，用Ⅰ和RⅠ分别双酶切Pcpc560+0495片段和p5S0646UD 同源臂，切胶回收，用T4 DNA Ligase进行连接，将连接后的产物转化大肠埃希菌Trans 5α感受细胞，得到质粒0646UD+Pcpc560+0495；用HⅠ单酶切0646UD+Pcpc560+0495质粒和Puck-4k质粒(含有卡那霉素抗性片段)，T4 DNA Ligase连接酶切片段并转化大肠埃希菌Trans 5α感受态细胞，通过筛选阳性克隆、生物摇床振荡培养，获得质粒0646UD+Pcpc560+0495+Kan(以下简称p0495)。

表1 引物序列

1.2.4 集胞藻PCC6803的自然转化及突变株的筛选

集胞藻PCC6803的转化方法参考Chen等进行转化。离心6～8 mL对数生长期(=0.6～0.8)的野生型集胞藻PCC6803，弃上清，收集集胞藻。用1 mL新鲜BG-11液体培养基重悬藻泥，加入6～10 μL p0495质粒，弱光温育6 h，3 h轻轻翻转混匀一次，将温育后的藻细胞均匀涂在放有混合纤维素(MCE)膜的BG-11固体平板上，24 h后将MCE膜转接到卡那霉素终浓度为50 μg·mL的BG-11固体平板上，在 30 ℃、50 μmol·m·s条件下培养，7～10 d长出转化子，挑取单藻落在含有卡那霉素的BG-11固体平板上进行继代筛选3次，至卡那霉素终浓度为150 μg·mL，挑取单藻落于 BG-11 液体培养基(卡那霉素，50 μg·mL)中，并置于摇床上培养。

待突变株生长至对数期后，提取突变株基因组DNA，使用表1所示的部分引物对藻株进行DNA和RNA水平的检测，筛选出转化完全的突变株。

1.2.5 突变株RNA水平的检测

收集生长至对数期的藻液，离心后弃上清，用Trizol试剂法提取总RNA，用超微量分光光度计测量总RNA的纯度和浓度，将RNA样品反转录为cDNA。以0495-Flag-F和0495-Flag-R为引物对扩增目的基因的表达进行检测。

1.2.6 胁迫处理

收集对数生长期(=1.0)的藻细胞，加入新鲜BG-11培养基清洗，离心，弃上清；分别用普通BG-11液体培养基和50% NaNOBG-11液体培养基(相对于普通BG-11培养基中氮浓度的50%，以下简写为50% N)重悬藻细胞，调整至定值(本次实验调整值为0.231)，分别置于20 ℃和30 ℃、光照强度为50 μmol·m·s条件下培养15 d，每组做3个生物学重复。

1.2.7 突变株脂肪酸组分分析

离心收集培养至对数期(=0.62)的野生型和突变株藻液，烘干后称取200 mg藻粉于研钵中加入液氮研磨3～5次，用甲醇-氯仿等有机溶剂萃取法提取其总脂肪酸。样品制备详细步骤如下：藻粉中加入体积比为2∶1的甲醇-氯仿溶液，利用超声波辅助萃取藻株中的脂质，将超声后的液体静置6 h，9 000 r · min离心10 min，收集上清至50 mL离心管中；重复上一操作3次；将收集的有机相转移至分液漏斗，加入氯仿和1% NaCl溶液，混匀，静置6 h，回收下层相；在未回收的上中层相中加入2.5 mL氯仿，混匀，静置，回收下层相；合并下层相至50 mL离心管中，放入烘箱中烘干至恒重，得到总油脂；将提取的总油脂转移至10 mL具塞试管中，并用氯仿溶解；加入5.0 mL 0.04 mol · L的氢氧化钾-甲醇溶液，混匀；将具塞试管置于水浴锅(60 ℃)中皂化1 h，每10 min颠倒混匀一次；待水浴锅取出的样品冷却，加入体积比为1∶9的4.0 mL盐酸-甲醇溶液混匀，再加入20 μL浓度为1.5 mg·mL的十九碳酸内标，水浴20 min，每10 min振荡一次；待上述样品冷却，加入3.0 mL饱和食盐水，1.0 mL正己烷，振荡后静置6 h；收集正己烷层样品。将提取的总脂肪酸经皂化、甲酯化、萃取、脱水处理后，送至公司用GC-MS(赛默飞气相色谱质谱联用仪)进行脂肪酸组分的分析。

1.2.8 光合色素的测定

取500 μL培养至对数时期的藻液于1.5 mL离心管中，离心，弃上清，加入1 mL N-N二甲基甲酰胺，吸打混匀，离心，取上清，使用723型紫外可见分光光度计测其在461 nm、625 nm、664 nm的光密度值，用如下计算公式计算出不同处理不同时期的叶绿素和类胡萝卜素含量：叶绿素(μg·mL)=12.1×-0.17×；类胡萝卜素(μg·mL)=(-0.046 ×) × 4。

1.2.9 光系统Ⅱ(PSⅡ)最大光化学量子产量

取生长至对数期的藻液，根据胁迫处理条件不同，分别用新鲜BG-11液体培养基和50% N BG-11液体培养基，将各组藻液吸光值调整为=0.689，将样品放入测量瓶中，黑暗处理20 min，在黑暗环境中轻轻上下颠倒混匀，于光合效率分析仪(PEA，Hansatech)中检测 PSⅡ最大光化学量子产量。

1.3 数据处理

采用Graphpad Prism6 软件进行数据处理以及作图。

2 结果与分析

2.1 同源重组平台p5ST1T2-slr0646UD的构建

提取集胞藻PCC6803基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2-A所示。由图可知，基因组条带清晰且弥散较少，可以用作后续实验研究。图2-B为同源重组平台在DNA水平PCR扩增检测图(实验中所用Marker均为2K plus DNA Marker)，图2-C为同源重组平台载体构建模式图。由图2-B、C可以看出，同源重组平台检测片段大小与理论值大小一致，且测序结果与实际序列一致。以上结果说明，同源重组平台p5sT1T2-0646UD(以下简称0646UD)构建成功，可用作下一步实验研究。

A，集胞藻PCC6803基因组DNA电泳结果；B，slr0646UD DNA水平PCR扩增结果；C，slr0646UD 同源重组平台质粒构建图；WT，集胞藻PCC6803。

2.2 过表达菌株的鉴定

以野生型集胞藻PCC6803和突变株0495基因组DNA为模板，分别用Pcpc560-F和0495-R引物对、Pcpc560-F和T1T2-R引物对、0646U-F和T1T2-R引物对、Pcpc560-F和0646D-R引物对、0646U-F和0646D-R引物对进行PCR扩增检测。凝胶电泳结果如图3所示，野生型集胞藻PCC6803中除去0646U-F、0646D-R引物对PCR扩增出2 000 bp的条带，其他引物未扩增出条带，且突变株0495的基因组扩增所得条带大小与图3-A理论值大小一致，以上结果表明，已成功筛选出阳性转化子0495(图3-B)。

A，同源重组质粒slr0495(+)构建图谱；B，突变株slr0495(+) PCR扩增检测图；C，突变株slr0495(+) RNA水平鉴定；WT，集胞藻PCC6803；M，突变株slr0495(+)。

在RNA水平检测突变株0495中过量表达0495基因的表达量。电泳结果表明，在突变株中检测到了带有Flag标签的目的条带(198 bp)，而野生型中未检测出此条带(图3-C)，说明过量表达的0495基因已经在野生型集胞藻PCC6803中被转录。

2.3 温度及氮浓度对突变株slr0495(+)生长速率的影响

为了探究光照及氮浓度对藻株生长的影响，将野生型集胞藻PCC6803和突变株0495分别在20 ℃和30 ℃中分别用普通BG-11和50%缺氮BG-11液体培养基进行培养，并测定其生长情况。图4-A中，在 30 ℃培养条件下，野生型和突变藻株在 BG-11 液体培养基和 50% N BG-11 液体培养基中生长速率没有明显差异，但突变株0495在50% N培养基中生长至对数后期时生长速率略低；20 ℃培养条件下，在BG-11液体培养基和50% N BG-11液体培养基中突变株0495生长速率高于野生型集胞藻PCC6803，在BG-11液体培养基中尤为明显。30 ℃和 20 ℃条件下相比，藻株在30 ℃培养条件下总体生长速率高于20 ℃培养条件。以上结果表明，过量表达0495基因后，温度对突变株0495的生长影响较大。

A，30 ℃、50 μmol· m-2·s-1、不同氮浓度条件下的生长曲线；B，20 ℃、50 μmol·m-2·s-1、不同氮浓度条件下的生长曲线；WT，集胞藻PCC6803；M，突变株slr0495(+)。

2.4 叶绿素a和类胡萝卜素含量的测定

叶绿素a是衡量植物光合作用的一个重要指标。如图5所示，20 ℃条件下野生型和突变株叶绿素a含量明显低于30 ℃培养条件下处理藻株，在20 ℃胁迫条件下的藻株在对数期叶绿素a的含量明显要高于其稳定期的含量。综上，与类胡萝卜素含量相似，影响集胞藻PCC6804和突变株0495中叶绿素a含量产生差异的主要是温度，氮浓度产生较大差异主要在稳定期。

A，30 ℃、50 μmol·m-2·s-1不同氮浓度培养条件下叶绿素a含量；B，20 ℃、50 μmol·m-2·s-1不同氮浓度培养条件下类叶绿素a含量；WT，集胞藻PCC6803；M，突变株slr0495(+)。

类胡萝卜素可以吸收和传递光能，并可以保护叶绿素。如图6所示，20 ℃培养条件下野生型和突变株类胡萝卜素的含量低于30 ℃培养条件。在20 ℃培养条件下，野生型和突变株类胡萝卜素含量在稳定期有明显差异，氮浓度对野生型集胞藻PCC6803和突变株0495生长胁迫主要出现在稳定期，温度是野生型藻株和突变株类胡萝卜素差异的主要因素。

A，30 ℃、50 μmol·m-2·s-1不同氮浓度培养条件下类胡萝卜素含量；B，20 ℃、50 μmol·m-2·s-1不同氮浓度培养条件下胡萝卜素含量。

2.5 总脂肪酸的测定及脂肪酸组分检测分析

使用GC-MS检测野生型集胞藻PCC6803和突变株0495中脂肪酸组分含量，结果如表2所示。由实验结果可知，在不同的胁迫条件下，集胞藻PCC6803和突变株0495脂肪酸组分均有不同程度变化。低温(20 ℃)和缺氮(50% N)培养条件下野生型和突变株总脂肪酸(TFA)含量均有上升趋势。在 30 ℃培养条件下，50% N BG-11液体培养基处理的野生型和突变株中C12∶0、C16∶0 和 C18∶0 含量明显升高，在50% N BG-11液体培养基中生长的突变株分别比普通BG-11液体培养基生长的野生型藻株C16∶0和C18∶0的含量提高了39.29%和18.49%。20 ℃培养条件下，与普通BG-11液体培养基相比，在50% N液体培养基中生长的突变株C11∶0含量降低了0.31 mg·g，C18∶3含量比30 ℃培养条件下普通BG-11培养基中野生型藻株增加了43.71%；在20 ℃培养条件下，与普通BG-11液体培养基相比，在50% N 培养基中生长的野生型和突变株TFA含量分别增加了4.92 mg·g和8.13 mg·g，C11∶0、C12∶0、C16∶0和C18∶0含量也有所上升，尤其在20 ℃、50% N培养条件下突变株0495C16∶0和 C18∶0的含量均是野生型藻株在30 ℃、100% N培养条件下的1.89倍。

表2 不同胁迫条件下野生型和突变株slr0495(+)脂肪酸组分的含量

以上结果表明，在集胞藻PCC6803中过量表达0495基因促进了中长链脂肪酸的积累，低温(20 ℃)和缺氮(50% N)培养条件下，进一步提高了藻株中中长链脂肪酸含量。

2.6 PSⅡ最大光化学量子产量的测定

PSⅡ最大光能转化率(/)的大小反映了PSⅡ的活性强弱。如图7所示，实验结果表明，在20 ℃培养条件下，对数期生长的藻株(野生型和突变株)/明显低于 30 ℃培养条件，具有显著性差异(<0.01)，低温降低了光系统Ⅱ的最大光能转化率。

图7 不同温度及氮浓度条件对藻株的Fv/Fm值的影响

在20 ℃培养条件下，突变株在普通BG-11液体培养基中培养和在50% N培养基中培养/值无显著性差异，其他各组两两对比均具有显著性差异(<0.05)，野生型在50% N培养基中/显著升高，这可能是藻株在胁迫条件下为提高光合速率做出的应激反应。突变株0495/差异不明显，可能是因为0495基因促进了氮元素的利用率。在20 ℃培养条件下0495基因过表达不会影响藻株的最大光能转化率。突变株在30 ℃、50% N 条件下培养，说明0495基因过表达促进了藻株对氮元素的利用，提高了PSⅡ光化学效率。

3 讨论

集胞藻PCC6803是理想的蓝藻基因工程受体，具有天然的DNA转化系统，同源重组转化平台(0646UD平台)的构建为利用同源重组手段在集胞藻PCC6803中基因表达研究奠定了基础。在同源重组平台构建过程中，上下游同源臂的选择是构建同源重组平台的关键点。研究表明，集胞藻0646基因可作为中性位点，我们在前期构建同源重组平台过程中，将已构建的同源重组平台0646UD插入卡那霉素抗性片段，获得0646UD-Kan质粒，将空载体成功转化野生型集胞藻PCC6803，测量其生理生化指标，结果表明，未对其生长产生影响。因此，0646UD平台可以用作集胞藻PCC6803转化过程的同源重组载体。

已有研究表明，低温可以促进藻株中脂肪酸的积累。研究表明，不饱和脂肪酸不仅可以增加细胞膜的流动性而且可以促进生物膜上酶的活性，对生物膜有着重要意义。温度过低会影响磷脂中多不饱和脂肪酸的合成，从而抑制了细胞膜的流动性，影响藻株的生长，不利于脂肪酸积累。本实验选择20 ℃处理藻株，与普通BG-11培养基相比，藻株在缺氮(50% NaNO)培养基生长条件下中长链脂肪酸含量相对较高，可能是因为在缺氮培养基中，由于矿物质氮的缺乏会抑制细胞分裂，增加微藻中三酰甘油(TAG)的积累。Yang等通过转录组测序发现，在缺氮培养后的微藻有1 213个差异基因表达量上调，其中包括碳固定、三羧酸循环、氮同化基因和甘油代谢等关键基因，藻株为了适应胁迫做出应激反应，使TAG中的饱和脂肪酸迅速演变为不饱和脂肪酸，在不同程度上增加了膜脂中部分不饱和脂肪酸的含量，从而促进了总脂肪(TFA)含量积累。

在培养温度为 30 ℃、光照强度为50 μmol·m·s光照培养条件下，突变藻株0495与野生型集胞藻在生长对数后期有明显的颜色差异，与野生型藻株相比，突变株颜色新鲜翠绿，这可能是因为，PSⅡ最大光化学量子产量是植物在胁迫条件下光合抑制现象的一个灵敏指标，/的高低反映了植物光合速率的大小，/在不同的藻株、不同的胁迫条件下对光的利用率产生了变化从而使得PSⅡ的相关色素发生变化，过表达0495基因改变了藻株对光的利用率，使得叶绿素a含量和类胡萝卜素含量发生了变化。此外，也可能是因为胁迫条件促进了集胞藻产生胞外多糖，胞外多糖中含有壳聚糖，从而影响了藻株的颜色变化。

本研究利用基因工程手段在集胞藻PCC6803中对0495基因进行过量表达研究，结果表明，过量表达0495基因增加了集胞藻PCC6803中长链脂肪酸的含量，并且在低温(20 ℃)、缺氮(50% NaNO)培养条件下中长链脂肪酸含量得到进一步提高。本研究为探究0495基因功能以及在逆境中基因产生的应激反应奠定了基础，为微藻高产中长链脂肪酸研究提供了理论依据。