金钗石斛提取物对5种耐药菌的体外抑菌活性评价

王建梅，王国盼，陆安静，秦 琳，鲁艳柳，白朝钧，何芋岐，谭道鹏

(1.遵义医科大学 贵州金钗石斛产业发展关键技术工程研究中心，贵州 遵义 563099；2.贵州纳蒂尔生物科技有限公司，贵州 遵义 563000)

细菌进化选择是细菌耐药性产生的主要原因，而近些年抗生素的滥用更加剧了耐药菌的产生，为临床用药有效性及安全性带来了极大挑战[1]。金黄色葡萄球菌是自然界分布最广泛的革兰氏阳性球菌之一，也是引起疾病最重要的致病菌之一；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)对β-内酰胺类、头孢菌素类抗生素均耐药，并可能对氨基糖苷类和大环内酯类等抗菌药物表现出耐药[2]。大肠埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)、铜绿假单胞菌(PA)和肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae,Kleb)也是临床较为常见的条件致病菌，均有严重的多重耐药性[3]。由于抗生素和抗菌药物的广泛使用，耐药菌现象的产生无法避免。中医药强调人与自然的统一关系，并具有多靶点和多成分等特点。因此，从来源广泛的中药材中寻找安全有效的天然抑菌剂成为近年来研究的热点。

金钗石斛(DendrobiumnobileLindl.)是我国传统名贵中药材，早在《神农本草经》中就有记载。临床上常用于“胃阴不足，病后虚热不退，热病津伤，骨蒸劳热，食少干呕，阴虚火旺，目暗不明，口干烦渴，筋骨痿软”等症[4]。现代药理研究发现金钗石斛具有抗血栓[5]、抗肿瘤[6]、抗氧化[7]、抗衰老[8]等多种药理作用[9]。金钗石斛生长于阴暗潮湿的山间林下，在这种微生物丰富自然环境胁迫下，金钗石斛产生出较强的抵御微生物能力。为此，本文通过对不同极性部位金钗石斛提取物的体外抑制金黄色葡萄球菌等5种耐药菌的活性评价，比较金钗石斛不同极性部位提取物的抑菌效果，为今后开发以金钗石斛为原料的天然抑菌剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 菌株金黄色葡萄球菌ATCC29213、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯氏菌ATCC700603、大肠杆菌ATCC25922，由遵义医科大学基础药理教育部重点实验室提供。

培养基 MH肉汤培养基(青岛日水生物技术有限公司)、琼脂粉(biosharp)、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(上海泰坦科技股份有限公司)、二甲基亚砜(北京绿泽生物技术有限公司贵州分公司)

金钗石斛药材采自贵州省赤水市，经遵义医科大学药学院吴发明副教授鉴定为金钗石斛(DendrobiumnobileLindl.)的茎。

1530酶标仪(美国 Thermo 公司)，XFH-50CA电热式压力蒸汽灭菌器(浙江新丰医疗器械有限公司)，电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，MJX-150生化培养箱(金坛市城东新瑞仪器厂)，VD-650桌上型(垂直送风)净化工作台(上海尚道仪器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 金钗石斛不同极性部位的制备 称取干燥的金钗石斛药材50 g，置2 000 mL圆底烧瓶中，按1∶12的固液比加入蒸馏水，回流提取2次，每次1 h，合并提取液，静置冷却，过滤，滤液减压浓缩成浸膏状，置烘箱干燥，作为水提物(WE)；再称取金钗石斛药材200 g，置于5000 mL圆底烧瓶，以1∶12的固液比，加入70%乙醇溶液2 400 mL，回流提取2次，每次1 h，合并提取液，过滤，浓缩至浸膏状。取一部分浸膏干燥，作为乙醇提取物(EE)；剩余部分用加热至50 ℃左右的蒸馏水100 mL使其均匀分散，依次用100 mL的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，分别萃取3次[10]，合并萃取液后，经减压浓缩、干燥，得石油醚部位(PE)、乙酸乙酯部位(EAE)和正丁醇部位(BE)提取物，将以上5种金钗石斛提取物分别密封放置于4℃冰箱[11]，备用。

1.2.2 供试液的制备 记录不同极性部位金钗石斛提取物质量，分别精密称取1.20 g用6.00 mL二甲基亚砜溶液(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，混合均匀，得到200 mg/mL的不同极性部位的金钗石斛供试液。

1.2.3 培养基的配置 MH肉汤培养基：取MH培养基粉末22.00 g，精密称定，加三蒸水均匀搅拌至充分溶解，定容至500 mL，置121 ℃ 电热式压力蒸汽灭菌器中，高压灭菌30 min，冷却至室温，置4 ℃冰箱，密封保存，备用。

MH琼脂培养基：每100 mL MH液体培养基中加入2～3 g琼脂粉，置121 ℃ 电热式压力蒸汽灭菌器中，高压灭菌30 min，冷却至45 ℃倒入琼脂培养皿平板，凝固后，密封置4 ℃冰箱保存[12]，备用。

1.2.4 菌株标准曲线的制备 实验前，生物安全柜紫外照射30 min; 将冻存的金黄色葡萄球菌(SA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、大肠埃希氏菌(E.coli)、铜绿假单胞菌(PA)、肺炎克雷伯菌(Kleb)复苏，采用平板划线法接种在MH琼脂培养基，于37 ℃恒温培养箱中培养16～18 h；挑取MH琼脂培养基上单个菌落于装有适量MH肉汤培养基的离心管中37 ℃，180 r/min振荡培养8 h至菌液浑浊；分别取0、50、100、150、200、250、300、350 μL菌液，用MH肉汤培养基定容至1 000 μL，混匀后用酶标仪在600 nm处测定光密度(OD)；将系列不同浓度菌悬液进行10倍稀释，取10-6稀释液0.1 mL置于琼脂培养皿，均匀涂布，于37 ℃恒温培养箱中培养16～18 h，统计培养皿上菌落数，平行重复3次，计算均值，以OD值为横坐标，对应菌落数的对数为纵坐标，绘制各个耐药菌标准曲线见表1。

1.2.5 菌液制备 参考文献[13]方法，菌种复苏后划线接种于MH琼脂培养基，置37 ℃恒温培养箱培养24 h。用接种环分别挑取MH琼脂培养基上单个菌落于适量 MH肉汤培养基，37 ℃、180 r/min条件下，振荡至菌液浑浊。分别吸取各个菌悬液200 μL于96孔无菌培养板内，迅速放置酶标仪中,600 nm波长处测定各培养孔OD值。根据测得的OD值代入标曲，计算得到菌落数，稀释细菌浓度至5×104cfu/mL，即为实验菌悬液。

1.2.6 最小抑菌浓度的测定 参考Carla Araya-Cloutier等[14]报道的方法，采用二倍微孔稀释法，测定不同极性部位金钗石斛提取物对SA、MRSA、PA、Kleb、E.coli五种供试菌的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)。将制备好的供试药液依次取1 mL加入1 mL无菌水系列倍比稀释，得不同浓度的系列样品溶液[10]。取菌悬液,稀释至浓度约为3×105cfu/mL,接种于96孔无菌培养板内。第1-5列每孔均加入180 μL菌悬液和20 μL供试药液,第6列每孔加入MH肉汤培养基,第7列每孔加入200 μL菌悬液；另取50 μL供试药液同法操作。均置于37 ℃培养箱培养12 h后,观察浑浊程度。部分供试液存在颜色，吸取菌悬液和供试药液，均匀涂布到琼脂平板培养基上，继续培养12～16 h，鉴定实验结果。观察菌落生长情况，以不生长菌落的最高药物稀释浓度为药物的最小抑菌浓度(MIC)。平行3次试验，以3次结果相近为标准[15]。

1.2.7 抑菌活性测定 在已紫外30 min的生物安全柜中，将滤纸片(直径6 mm)分别浸泡于药液中4～5 h，吸取浓度约为5×105cfu/mL的菌悬液100 μL均匀涂布在MH琼脂培养基上，将供试药液滤纸片和空白滤纸片(DMSO溶液浸泡)分别贴在琼脂培养基上，37 ℃恒温培养24 h，测量抑菌圈的大小[16]。

2 结果

2.1 菌株标准曲线 五种耐药菌株的标准曲线方程如表1所示。

表1 耐药菌标准曲线方程

2.2 最低抑菌浓度 通过二倍微孔稀释法对五种提取物进行最低抑菌浓度测定，选取了临床常见的两种革兰氏阳性菌(SA、MRSA)和三种革兰氏阴性菌(PA、Kleb、E.coli)作为试验菌株。如表2所示，在五种提取物中，EAE表现出最强的抗菌活性，它能较为明显抑制5种菌株的生长，并且明显抑制SA、MRSA、PA的生长，最低抑菌浓度为10 mg/mL；EE对SA的抑菌活性也较强，MIC值为10 mg/mL；PE部位除对MRSA有较强抑菌活性外，对其它菌株敏感性均较低；5个不同极性部位对SA、MRSA、PA的抑制作用趋于一致，而对E.coli和Kleb的抑制作用均较弱。以上结果表明，对金黄色葡萄球菌起抑制效果的成分主要存在于EAE和EE部位，对MRSA和PA起抑制效果的成分主要存在于EAE部位，MIC值均为10 mg/mL。

表2 不同极性部位金钗石斛提取物最低抑菌浓度(MIC)的测定结果

2.3 抑菌活性 采用纸片扩散法对5种提取物进行抗菌活性测定[17]，结果如表3所示，5种提取物对MRSA的抑菌效果均较好，抑菌圈直径分别为BE(12.25±1.65)mm、PE(17.25±1.25)mm、EAE(15.75±0.48)mm、EE(11±0.63)mm、WE(13±0.82)mm，说明石油醚萃取部位的效果最好，正丁醇萃取部位和乙醇提取部位对PA、水部位对E.coli均无抑菌圈，说明抑菌活性不明显。

表3 不同极性部位金钗石斛提取物的抑菌活性

3 讨论

中药以其多成分、多靶点的作用特点及不良反应少、无耐药性、价格低廉等优点越来越多的受到国内外学者的重视[18]。传统中医认为金钗石斛性微寒，味甘，归胃、肾经，用于食少干呕，热病伤津，病后虚热，浅表性胃炎，滋阴降火，口干烦渴，慢性结肠炎等一系列病症，目前对于金钗石斛的研究主要集中于其化学成分及其抗阿尔兹海默症、抗肿瘤等药理作用[19]，而对金钗石斛的抗菌活性研究报道较为少见。

在本研究中，首先采用水提法和醇提法得到水提物和乙醇提取物，并将一部分乙醇提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取得到不同极性部位的金钗石斛提取物，通过二倍微孔稀释法和滤纸片扩散法比较考察了不同极性部位金钗石斛提取物对5种常见耐药菌的抑菌活性。结果显示，金钗石斛乙酸乙酯部位(EAE)表现出对5种菌株均有显著抑菌活性，而水提取部位的抑菌效果均较差，尤其是对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌几乎没有抑制作用。

在观察5种不同极性部位金钗石斛提取物抑菌效果时，用DMSO溶解后提取物本身存在一定颜色，或有浑浊现象，可能造成一定的误差，从而影响实验结果的准确性，因此采用二倍微孔稀释法与琼脂平板法相结合来评价其最低抑菌浓度[20]。

对比不同极性部位金钗石斛提取物的抑菌作用发现，EAE的抑菌作用最强，其次是BE和EE，PE除对MRSA具有一定的抑制作用外，对其他菌种抑制作用不明显，而WE的抑菌作用最差。因此，5种提取物的抑制活性依次为EAE>EE>BE>PE>WE。与王亚萍等[21]报道的金钗石斛醇提物的抑菌效果显著，而水提物几乎没有抑菌性或抑菌性较弱的结果基本一致。纸片扩散法研究结果表明，5种提取物对MRSA均有较强的抑菌作用，PE的抑菌直径为(17.25±1.25)mm，但对其余4种菌株的抑菌效果差；EAE对MRSA的抑菌圈直径为(15.75±0.48)mm，且对其余4种菌株也有一定抑制作用，其抑菌圈直径依次为MRSA> Kleb> E.coli> PA> SA。以上结果表明，金钗石斛中对SA具有抑制作用的成分主要存在于EAE和EE部位,对MRSA和PA起抑制作用的成分主要也在EAE部位，5种提取物对Kleb和E.coli 抑菌作用均较差。有文献报道金钗石斛的多糖类成分具有一定抑菌作用[15]，而多糖类成分主要集中于水提取物，但是本研究结果显示金钗石斛水提物抑菌活性最弱，而其乙酸乙酯部位抑菌作用最强，根据已有报道金钗石斛化学成分的极性判断，金钗石斛中主要发挥抑菌作用的化学成分可能为能够富集于乙酸乙酯部位的生物碱、菲类、联苄类成分。

综上所述，金钗石斛乙酸乙酯部位(EAE)具有较强的抑菌活性，且对革兰氏阳性菌的抑菌活性优于革兰氏阴性菌，可以为今后金钗石斛抑菌制剂的开发提供参考。

致谢：感谢遵义医科大学基础药理教育部重点实验室周红教授、黄雅思教授提供本文实验菌种，并给予实验指导。