冷冻切片流程中的常见问题及优化措施

王 丽，董 岩，陈 芸

冷冻切片技术是临床病理学诊断中常用的一种技术方法，其主要原理是在低温环境下使组织在较短时间内达到适合的硬度，随后进行快速切片、染色完成制片工作，进而于显微镜下观察切片对肿瘤性质进行判定，为临床医师在手术中确立手术方案提供强有力的支撑[1]。冷冻切片质量直接影响了术中病理医师快速诊断的速度及准确率，因此，在短时间内完成一张优质的冷冻切片非常重要。该文根据2016～2021年云南省肿瘤医院病理科使用德国徕卡CM1950恒冷冷冻切片机进行术中冷冻制片过程中的一些操作体会及常见问题进行总结及探讨。

1 标本接收

当病理医师接收到冷冻标本时，首先应与临床医师核对患者的基本信息，包括患者姓名、住院科室、住院号、标本取材部位及标本名称等，核对正确后再进行登记，避免差错医疗事故的发生。同时，应注意离体时间太长的标本组织细胞坏死严重，影响结果判定，不宜进行术中冷冻，因此行术中冷冻的标本应尽量减少中途停留时间，尽快送检。

2 取材

(1)取材过程中，取材医师需要在短时间内找到该标本正确的病变位置。一些样本病变不明显或肿块较小易被遗漏，如甲状腺微小癌，而有些标本需要广泛取材，如乳腺导管原位癌、甲状腺腺瘤等，因此需要取材医师正确、快速、全面细致的取材[2]。在取材过程中，杜绝病变组织间的交叉污染，避免误诊的发生。(2)除正确取材外，送检行术中快速冷冻切片的标本应是新鲜的活体组织，禁止添加任何固定液，亦不能用水清洗，若表面血液或其他液体过多时可先用滤纸将其表面水分吸干后再进行取材，取材的器械需保持干燥，主要是为了防止在速冻过程中组织内部出现冰晶空洞，以致组织变形，细胞增大，严重影响诊断结果[3]。(3)冷冻取材的大小厚度应适宜，一般应控制在0.2 cm×1.5 cm×1.5 cm～0.5 cm×1.5 cm×1.5 cm。太大太厚会造成组织冷冻速度减慢，产生冰晶。太小太薄的组织会造成切片困难，病变消失，结果不理想等问题。(4)取材完成后需和取材医师核对病理号，保证除用于冷冻诊断的其余组织放至对应的包埋盒中，防止标本错放的现象发生。

3 切片、固定及染色

用于冷冻诊断的组织连同对应的条码一同放在冷冻支撑托上，进行快速冷冻，减少组织内冰晶的产生。

3.1 组织的冷冻温度选择一般冷冻切片机的温度以-22～-18 ℃为宜，也可根据不同的组织类型进行不同冷冻温度的调节，云南省肿瘤医院病理科接收到的标本主要为甲状腺、肺、乳腺、淋巴结及子宫标本。乳腺、卵巢、肺、子宫等标本的冷冻温度控制在-22～-18 ℃，胃、肠、阑尾等标本的冷冻温度控制在-20～-18 ℃，甲状腺、肝、肾、脾、淋巴结、易碎组织等标本的冷冻温度控制在-15 ℃左右，带少量脂肪组织控制在-25 ℃左右，含大量脂肪或全部为脂肪时，可考虑先在液氮中迅速冷冻，再放入-30 ℃左右冷冻切片机内进行切片[4-5]。

3.2 冷冻合格的组织切片(1)采用直接切片法，组织速冷后先进行粗修，修至合适的切面进行切片，用毛笔将卷曲的组织片刷平后贴起平整的组织切片。切片的完整性对病理医师的诊断十分重要，切片破碎不全、有缺损的原因主要有[6]：①组织脂肪或坏死组织过多；②组织块冷冻时间太长、太硬，切片时易碎裂不成片；③组织块边缘带有包膜、皮肤、组织过大或冰晶形成，难以切片；④组织过小，无法修到组织的最大切面；⑤切片刀太钝或较脏、切片出现刀痕，使切片不完整；⑥切片者操作方法不正确，速度快慢不均匀，用力不平衡等使得切片不完整。(2)较小组织制作切片时，先在支撑托表面放上适当OCT进行冷冻，等OCT冷冻完成后再将组织块放于其上进行切片，切片时应少修，防止组织病变部位的丢失。(3)切片厚度：原则为细胞密集且体积小的组织，如淋巴结，要薄切；纤维多、细胞稀少且体积大的组织可厚切，如脑组织、脂肪组织。切片完成后组织贴好在载玻片上应立即放入冷冻固定液中固定，固定完成后取出切片，待切片上固定液稍干燥后再放入加热的苏木精中进行染色。

4 染色流程

冷冻切片的染色步骤：加热苏木精(1～2 min)→水洗→盐酸乙醇分化→水洗→温水蓝化→80%乙醇→醇溶性伊红(30 s左右)→80%乙醇→90%乙醇→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇→100%乙醇→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→封片→贴标签。

HE染色的关键在于深浅适度，对比明显。染色良好的切片镜下核质对比清晰，蓝红相映，核膜及核染色质颗粒清晰可见(图1A)，HE染色对比鲜明，若细胞核及胞质染色对比较差则增加诊断难度，使准确率降低(图1B)。

图1 冷冻制片镜下观察结果：A.染色良好；B.染色欠佳

5 冷冻制片组织的固定

待诊断医师签发报告后，取出冷冻组织，快速溶解OCT，再将组织放入对应病理编号的包埋盒中(图2)，此时应当注意组织放入包埋盒的正反面是否正确，确保冷冻切片和石蜡HE切片为同一面，放入充足的10%中性福尔马林中固定，如固定不及时或固定液量及浓度不足，易造成细胞蜕变，导致后续HE染色模糊不清。

图2 术中冷冻切片标本编号

6 讨论

冷冻制片技术是术中快速病理诊断的奠基石，如何在有限的时间内快速有效地完成冷冻制片，不仅是病理诊断的需要，更是术中临床医师的迫切要求。对于一些肿瘤体积较小，且患者临床无明显症状及发现比较困难的样本，通过术中快速冷冻病理诊断可为临床医师手术方式的选择提供合理依据，从而避免对患者进行二次手术的伤害，具有一定的临床意义。冷冻标本的取材具有一定的局限性，一些肿瘤标本体积较大，在有限时间内无法做到完全取材，难以进行全面观察，易造成漏、误诊。为减少及杜绝误诊的发生，在取材的过程中应做到仔细认真核对标本，防止病变部位的丢失和污染，同时在进行冷冻切片时严格遵守相关操作流程及质量控制，保障切片的质量，在实际的操作中需做到稳、准、快的工作效率，从而使得肿瘤病理诊断结果准确、真实、可靠。

冷冻切片质量与常规石蜡切片质量的差别主要是显微镜下组织细胞形态差别，因此影响冷冻切片的因素主要为组织取材的大小及厚度，组织冷冻切片的时间及温度等[7]。冷冻切片的关键是快速冷冻，快速冷冻可减少组织内冰晶的产生，一些取材较大的组织以及含水分较多的组织，常常冷冻速度过慢，易产生冰晶，冰晶一旦形成组织切片内会呈现细胞变形、条索状、空泡状或细胞增大等现象，从而严重影响术中快速冷冻病理诊断的结果[8-9]。冷冻切片比一般石蜡制片要求高、难度大，因此要求病理技术员在制片的各个环节和对不同组织成分的特性有充分的认识和掌握，从标本的送检、核对、取材、冷冻速度、切片温度及厚度、染色等每一个环节均要认真仔细对待，只有在工作中不断摸索、总结、改进和发现，才能制作出一张良好的冷冻切片。