如皋黄鸡不同产蛋时期卵巢卵泡变化规律分析

丁悦 张金璧 周欣怡 梁多敏 陈宽凤 张艳婧 谢永锋 邱家宝 徐世永

摘要：为探索不同产蛋时期如皋黄鸡卵巢卵泡变化规律，选取预产期（16周龄）、产蛋初期（20周龄）、产蛋高峰期（27周龄）、产蛋末期（64周龄）如皋黄鸡蛋鸡，对输卵管、卵巢重量、等级前卵泡数进行统计，同时卵巢进行组织切片HE染色后对原始、初级、次级卵泡进行了观察和测量统计，对不同阶段卵泡的数量变化进行了比较分析。结果表明：随产蛋时期的推进，卵巢、输卵管重呈上升趋势，4种等级前卵泡数量在产蛋高峰期达最高值;次级卵泡数量在预产期最高，不同直径的次级卵泡数量在产蛋期进程中变化规律有所不同;此外，初级卵泡平均直径在不同产蛋时期亦有差异。

关键词：卵巢;等级前卵泡;次级卵泡;如皋黄鸡;产蛋时期

中图分类号：S 831文献标志码：A文章编号：0253-2301（2022）04-0028-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2022.04.005

Analysis on the Change Rules of Ovarian Follicles in Rugao Yellow Chickensat Different Laying Periods

DING Yue， ZHANG Jin-bi*， ZHOU Xin-yi， LIANG Duo-min， CHEN Kuan-feng，ZHANG Yan-jing， XIE Yong-feng， QIU Jia-bao， XU Shi-yong

（College of Animal Science and Food Engineering， Jinling Institute of Technology， Nanjing， Jiangsu 210000， China）

Abstract： In order to explore the change rules of ovarian follicles in Rugao yellow chickens at different laying periods， by selecting the Rugao yellow chickens at the prelaying period （16 wk of age）， the early laying period （20 wk of age）， peak egg-laying period （27 wk of age）， and the telophase of laying （64 wk of age）， the statistics of the weight of oviduct， the ovarian weight， and the number of pre-hierarchical follicles were carried out. At the same time， theoriginal， primary and secondary follicles were observed and measured after the tissue section and HE staining of ovary， and the number changes of follicles at different stages were compared and analyzed. The results showed that the weight of ovary and fallopian tube showed an increasing trend with the development of laying period， and the number of four kinds of pre-hierarchical follicles reached the highest value at the peak egg-laying period. The number of the secondary follicles was the highest in the prelaying period， and the number of the secondary follicles with different diameters varied in the course of laying period. In addition， the average diameter of the primary follicle was also different at different laying periods.

Key words： Ovary; Pre-hierarchical follicles; Secondary follicle; Rugao yellow chicken; Laying period

如皋黃鸡俗称三黄鸡，具有黄喙、黄羽、黄脚特征，是江苏特色蛋肉兼用型鸡种，以江苏省如皋市及其周边城市为主要产区，2013年进入全国农产品地理标志登记保护名录。如皋黄鸡不仅是我国重要的家禽种质资源，其产蛋量较高且体重小，具有作为优良蛋鸡杂交亲本的潜力[1]。家禽没有发情周期和妊娠期，在一定的时间内连续排卵，产蛋期可分为预产期、产蛋前期、产蛋中期（即蛋高峰期）和产蛋后期。蛋鸡的产蛋期长短直接关系到整个养殖场的经济效益[2-3]，如皋黄鸡与现代蛋鸡品种类似，一般在20～21周龄开始产蛋;27～29周龄进入产蛋高峰期，大致可持续20周;54周龄后逐渐进入产蛋末期。

一般来说，家禽卵巢中卵泡的数量及发育状况是其产蛋性能的主要决定因素，出雏时鸡卵巢中的卵母细胞经过发育、选择和闭锁等机制建立起严格的等级体系[4]，分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡，成熟卵泡又分为等级前卵泡与等级卵泡[5-6]。等级前卵泡可根据体积大小和卵泡内卵黄物质沉积情况分为小白卵泡（SWF）、大白卵泡（LWF）、小黄卵泡（SYF）和大黄卵泡（LYF），而大黄卵泡会通过选择与优势化形成等级卵泡，进入等级发育时期，按顺序发育直至排卵[7]。理论上说，卵巢中卵泡的数量和质量是蛋鸡产蛋的物质基础，原始卵泡库的库存、初级卵泡和次级卵泡的储备以及各级卵泡的闭锁消耗的速率决定了家禽的生育年限[8]。因此，了解和完善各产蛋期的卵巢卵泡变化规律，有助于完善家禽产蛋生理机制，从而进一步开发家禽产蛋潜力[9]。D765F16B-4BFE-414D-9135-AE9A51FC7318

然而由于等级前卵泡肉眼难以直接观察，针对等级前卵泡的观察和统计较为少见[10]，且如皋黄鸡产蛋各时期的卵巢卵泡变化未有报道。本研究针对预产期、产蛋初期、产蛋高峰期和产蛋末期的如皋黄鸡，通过采样统计和组织切片、HE染色法及显微镜观察统计的方法，从大体和显微角度比较了不同产蛋时期母鸡生殖器官的大体变化和不同阶段卵泡的数量变化，探讨了不同产蛋时期的卵泡数变动规律，为蛋鸡的生殖调控提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验动物如皋黄鸡购自南京竹顺生物公司，分批选取同等条件下饲养的预产期（16周龄）、产蛋初期（20周龄）、产蛋高峰期（27周龄）、产蛋末期（64周龄）如皋黄鸡蛋鸡各12只。

1.1.2主要试剂与仪器生物显微镜（CHC，OLYMPUS），轮转式石蜡切片机（RM2128，Leica），4%多聚甲醛固定液、HE染色、PBS液等购自上海生工公司。

1.2试验方法

1.2.1样本采集颈部放血处死后采集输卵管并称重，测量输卵管长度。取包括各级卵泡在内的整个卵巢组织，去等级卵泡后稱重，测量并记录直径≥1 mm的卵泡数。各级前卵泡按直径大小依次划分为大黄卵泡（直径8～10 mm）、小黄卵泡（直径5～7 mm）、大白卵泡（直径2～5 mm）、小白卵泡（直径1～2 mm）。卵巢去掉≥1 mm卵泡后，将剩余组织放入4%多聚甲醇固定液进行保存用于制作石蜡切片。

1.2.2卵巢组织切片的制作及观察固定好的卵巢组织经过脱水、透明、浸蜡、包埋、按5 μm厚度进行蜡块切片，切片方向采取与卵巢系膜平行方向，取最大切片进行HE染色以获得更准确的卵泡计数[11]。

1.2.3卵巢组织切片的制作、观察及卵泡计数将固定后的卵巢组织送至生物科技公司脱水，石蜡包埋组织，制作石蜡切片，HE染色。显微镜观察每张玻片中不同阶段的卵泡，评定标准为：原始卵泡卵母细胞周围紧贴单层扁平状颗粒细胞，排列不规则;初级卵泡卵母细胞周围紧贴单层柱状颗粒细胞，排列整齐;次级卵泡卵母细胞周围的颗粒细胞变为多层且内有大量卵泡液[3]。同时对各级卵泡直径进行测量，对初级和次级卵泡进行计数。

1.2.4统计分析使用GraphPad Prism 7（GraphPad Software Inc，San Diego，CA）进行统计分析。三组间差异采用one-way ANOVA，二组间比较采用非配对T检验。所有结果表示为平均值±标准误（mean±SEM）。P<0.05和P<0.01分别表示差异显著和极显著。

2结果与分析

2.1不同产蛋时期卵巢及输卵管的大体变化分析

由图1可知，不同产蛋时期，如皋黄鸡卵巢均重变化明显，预产期、产蛋初期、产蛋高峰期和产蛋末期均重分别为（0.8±0.13）、（3.8±0.70）、（42.2±2.90）和（53.2±3.85）g，4个时期卵巢均重间差异显著（P<0.05）。在输卵管重方面，预产期、产蛋初期、产蛋高峰期和产蛋末期均重分别为（1.7±1.11）、（34.1±6.68）、（34.6±2.39）和（1.8±2.85）g，产蛋初期与高峰期差异不显著（P>0.05），预产期和产蛋末期输卵管均重显著低于产蛋初期和显著高于产蛋高峰期（P<0.05）。预产期、产蛋初期、产蛋高峰期和产蛋末期的输卵管平均长度分别为（12.6±1.38）、（49.7±6.76）、（45.6±2.73）、（59.1±1.20）cm，其变化趋势规律与输卵管重量一致，预产期和产蛋末期输卵管长度显著低于产蛋初期和显著高于和产蛋高峰期（P<0.05）。

2.2不同产蛋时期卵巢等级前卵泡数量变化分析

由图2可知，大黄卵泡（BYF）在产蛋初期、产蛋高峰期、产蛋末期平均个数分别为（4.6±0.78）、（7.4±1.43）、（6.2±0.94）个，但差异未达到显著水平（图2A）。小黄卵泡（SYF）在这3个时期平均个数分别为（5.1±1.06）、（12.4±1.04）、（5.3±0.97）个，产蛋高峰期数量显著高于其他2个时期（图2B）。大白卵泡（BWF）在产蛋初期、产蛋高峰期、产蛋末期平均个数分别为（10.1±1.92）、（14.7±1.96）、（13.3±3.42）个（图2C）。小白卵泡（SWF）在产蛋初期、产蛋末期平均个数分别为（27.6±3.42）、（42.1±6.88），产蛋高峰期数量过多难以准确统计（图2D）。总之，产蛋高峰期4种等级前卵泡的数量均呈现最高值，其中大黄卵泡和小白卵泡的平均个数差异显著，大黄卵泡和大白卵泡的平均个数在产蛋期未达到显著水平。

2.3原始和初级卵泡的组织学特征分析

对卵泡组织进行切片和HE染色，对如皋黄鸡卵巢中直径小于1 mm的卵泡，即原始、初级和次级卵泡的形态和大小进行了显微镜观察和统计。由图3可知，原始卵泡中，卵母细胞外围绕一层不规则、松散排列的扁平状颗粒细胞（图3A）;初级卵泡中，卵母细胞外围绕一层规则、紧密排列的立方状颗粒细胞（图3B）;次级卵泡中，卵母细胞外围绕两层以上规则、紧密排列的扁平颗粒细胞（图3C）。对不同产蛋时期初级卵泡的直径统计显示，初级卵泡平均直径为（42.3±1.4）μm，而在不同产蛋时期，卵巢中可见的初级卵泡大小略有不同，预产期、产蛋初期、产蛋高峰期和产蛋末期分别为（45.27±2.39）、（50.46±1.05）、（30.03±1.53）和（40.30±1.35）μm，其中产蛋初期卵巢中的初级卵泡平均直径最大，产蛋高峰期平均直径最小，均与另外两个时期差异显著（图4）。

2.4不同产蛋时期卵巢次级卵泡数量变化分析

为了解次级卵泡在不同产蛋时期的数量变化，选取每个卵巢与卵系膜平行的组织切片，对直径在1 mm以下的次级卵泡进行了相对数量的统计。将次级卵泡直径（图5A～D）由大到小分为400～1000、200～400、100～200和50～100 μm 4个小组分别进行统计。由图5可知，次级卵泡数量均在预产期较高，产蛋初期4个尺寸的次级卵泡数量均显著下降。随着产蛋期的推进，直径400～1 000 μm的次级卵泡在产蛋高峰期数量最少，在产蛋末期有所上升;直径200～400 μm的次级卵泡在整个产蛋周期变化不显著;直径100～200 μm组的次级卵泡在产蛋周期中逐渐增多，在产蛋末期数量最多;而直径50～100 μm组的次级卵泡数量在产蛋周期中逐渐减少，在产蛋末期数量最低。D765F16B-4BFE-414D-9135-AE9A51FC7318

3讨论与结论

鸡输卵管发生一般被分为3个阶段，第1阶段是1～8周龄的发育停滞期，第2阶段是9～17周龄的缓慢发育期，第3阶段是18～21周的快速发育期[12]，刘龙等[13]根据输卵管黏膜上皮细胞的发育情况将第13周龄、16周龄、17周龄和20周龄进一步定义为细胞增殖前期、细胞增殖后期、细胞分化前期和产蛋期，并证明了几个时期间具有差异性的基因表达谱。本研究进一步从大体水平探索了产蛋期的输卵管变化，从外观上看，输卵管在产蛋周期内持续发育，其长度在产蛋初期到末期见变化显著而增幅较小，但重量有较大幅度大增加，可见其发育主要体现在厚度，即输卵管黏膜上皮的柱状纤毛细胞和分泌细胞的增多上[14]。

不同产蛋时期的卵巢总重量（不含等级卵泡）随产蛋时期明显增加，从外观上看卵泡系带、卵巢间质结缔组织均随着产蛋期进展而增粗或增厚，对卵巢重量产生了一定影响[15]。此外，等级前卵泡的分离和统计显示，小黄卵泡、小白卵泡数量在产蛋高峰期呈现出最高值（由于产蛋高峰期小白卵泡数量过多，难以进行准确统计，因此未提供数值），大黄、大白卵泡在初期和高峰期间有上升趋势，但由于组内个体差异较大，没有达到显著差异。从趋势上看，各时期等级前卵泡均在高峰期呈现最高值，可见等级前卵泡的数量与个体产蛋能力有直接的对应关系。

根据切片观察显示，原始、初级、次级卵泡组织学差异显著，且原始、初级卵泡数量极多。本研究首次测量统计了不同产蛋期初级卵泡的直径大小，并发现卵巢中的初级卵泡直径随产蛋时期略有变化，产蛋初期最高而高峰期最低，这一变化提示产蛋初期初级卵泡的储备丰富，而高峰期大量初级卵泡进入次级阶段发育或经历了闭锁[16-17]。此外，次级卵泡的总数量在预产期（16周、112日龄）最高，进入产蛋周期后显著下降，这与海兰褐鸡生长发育过程（63、100、281、481日龄）中卵泡数量的研究中提出的，次级卵泡数在100日龄时达最高点一致[18]。值得注意的是，观察测量显示次级卵泡直径变化跨度较大（50～1000 μm），因此首次对次级卵泡进行了分段统计。而结果提示不同大小的次级卵泡变化有所差异，尤其直径100～200 μm的次级卵泡，在不同产蛋时期变化规律与其他直径的次级卵泡截然不同。

综上，本研究从大体和组织学角度比较了预产期、产蛋初期、产蛋高峰期和产蛋末期如皋黄鸡卵巢及卵泡数量变化，尤其对次级卵泡变化规律进行了探讨，为卵泡发育规律和机制研究及产蛋性能改善研究提供了参考。

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收稿日期：2022-03-20

作者简介：丁悦，女，2001年生，本科在读，主要从事畜牧学方面研究。

*通信作者：张金璧，女，1985年生，副教授，主要从事动物遗传育种与繁殖研究（E-mail：zhangjinbi@jit.edu.cn）。

基金项目：江苏省高等学校大学生创新创业训练计划（202113573016Z）;金陵科技学院“科教融合项目”（2021KJRH33）。D765F16B-4BFE-414D-9135-AE9A51FC7318