低温冷冻条件下消毒剂杀灭效果测定技术研究

黄甜甜　周志南　徐新怡　杨启立　夏琪琪　鹿燕

摘要： 目的   建立低温冷冻条件下消毒剂杀灭效果的测定方法。方法选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两种代表性的菌种，进行菌悬液配方和染菌载体优化，以市场流通的冷链低温消毒剂作为样品，进行低温杀灭效果的测定。结果在-40℃、-20℃、4℃、20℃温度下，常温消毒剂低温试验结冰无法进行杀灭试验;未优化的菌悬液低温下平衡会结冰影响试验结果，染菌载体菌落回收数明显降低;在配方优化后，低温消毒剂在相应低温下用悬液定量法作用10min后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭对数值均>5.00;载体喷雾定量法作用10min后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭对数值均>3.00。结论该方法的研究建立适用于新冠疫情下低温冷链低温消毒剂的杀灭试验，为其他实验室的低温模拟杀灭试验提供一定的参考价值。

关键词： 低温消毒剂载体杀灭效果

中图分类号：TB484.1文献标识码：A       文章编号：1672-3791（2022）07（a）-0000-00

Study on Determination Technology of Disinfectant Killing Effect Under Low Temperature Freezing Condition

HUANG Tiantian1，2  ZHOU Zhinan1，2  XU Xinyi1，2  YANG Qili1，2  XIA Qiqi1，2  LU Yan1，2

（1.Zhejiang Fangyuan Test Group Co.， Ltd;2.Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biosafety detection for Market Regulation，Hangzhou，Zhejiang Province， 310018 China）

Abstract： Objective To establish a method for determining the killing effect of disinfectants under low temperature freezing conditions. Methods Two representative strains of Escherichia coli and Staphylococcus aureus were selected to optimize the bacterial suspension formula and bacterial carrier. The cold chain low-temperature disinfectant circulating in the market was used as a sample to determine the low-temperature killing effect. Results At the temperatures of - 40 ℃， - 20 ℃， 4 ℃ and 20 ℃， the normal temperature disinfectant was frozen and could not be killed; The balance of non optimized bacterial suspension will freeze at low temperature， which will affect the test results， and the colony recovery number of infected carrier will be significantly reduced; After optimizing the formula， the logarithm of killing Escherichia coli and Staphylococcus aureus by the suspension quantitative method at the corresponding low temperature for 10 minutes was > 5.00; The killing rate of Escherichia coli and Staphylococcus aureus by 10min was 3. Conclusion The study of this method is suitable for the killing test of COVID-19 low temperature cold chain low temperature disinfectant， and it can provide some reference value for other laboratories in low temperature simulated killing experiments.

Key Words： Low temperature; Disinfectant; Carrier; Killing effect

低溫下的消毒是新冠肺炎疫情后面临的新问题，也需要安全有效的消毒剂和可靠的消毒方法，此前的消毒措施都是在常温情况下进行。而现在大家之所以关注低温下的消毒，是因为低温对消毒效果有明显的影响，低温有时候会导致消毒剂以及消毒能力显著下降，甚至会让这些常见的消毒产品完全“失灵”[1]。

徐莉等人[2]在低温环境下对某含氯消毒剂微生物消毒效果研究发现不同温度条件下含氯消毒剂溶液的有效氯含量变化较大，其中当温度为-20℃时，含氯消毒剂溶液呈结冰状态，对实验结果影响较大。张英涛[3]等研究了低温状态下常用消毒剂消毒效果评价;姜秀梅等人[4]研究发现温度对邻苯二甲醛杀灭分枝杆菌的效果影响较大，低温条件下其杀菌效果会降低。他们研究的低温条件是4℃左右的低温，未对-20℃和-40℃进行研究。

现行有效的消毒方法依据是按消毒技术规范（2002版）进行，都需要让消毒剂置于20℃水于5min后进行杀灭试验。温度对杀灭微生物效果影响的测定也只是设置以10℃、20℃、30℃等常规温度对消毒剂杀灭各种微生物的影响。基于目前我国食品冷链状况频发，迫切地需要一些能在低温下行之有效的消毒剂和消毒的方法[5]。

为解决全国疫情防控之急需，确保低温消毒效果，2021年1月国家卫生健康委办公厅印发了《国家卫生健康委办公厅关于印发低温消毒剂卫生安全评价技术要求的通知》（国卫办监督函﹝2020﹞1062号），其中附件《低温消毒剂卫生安全评价技术要求》对低温条件下实验室微生物杀灭试验、现场试验和低温试验进行了相对简单的阐述。实验室微生物杀灭试验也只用载体法进行试验，未对悬液定量法进行说明，为此该研究以已研发的低温冷冻消毒剂为代表，在低温条件下进行杀菌效果试验，建立用于冷链食品包装的消毒剂杀灭效果测定方法，为低温消毒试验提供参考。

1材料与方法

1.1材料

设备：高压灭菌锅、培养箱、生物安全柜、高低温试验箱、加热制冷浴槽等。

培养基及试剂：胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、聚山梨醇酯80（吐温80）、0.85%无菌氯化钠溶液、甘油。

中和剂：D/E中和肉汤（按消毒技术规范要求鉴定合格）[6]。

载体：不锈钢金属载片。

试验菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 6538、大肠杆菌8099均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

消毒剂：A：次氯酸钠（5%±0.5%）;

B：二氯异氰尿酸钠（0.3%±0.03%）+氯化钙（20%±5%）;

C：过氧化氢（3%±1%）;

D：苯扎氯铵（0.4%±0.04 %）+乙醇（35%±3.5%）;

E：二氯异氰尿酸钠（0.5%±0.05%）+氯化钙（30%±3%）;

F：过氧化的苄基烷基二甲基季铵盐化合物（0.4%±0.1%）。

1.2方法

1.2.1低温试验

取5mL消毒剂放置于相应低温下过夜（>8h），观察并记录其性状。该消毒剂保持液体状态、无析出、无结晶，则判定为合格。

1.2.2细菌悬液的制备

取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌新鲜培养物加入5mL0.85%无菌氯化钠溶液，洗下菌苔，并将洗脱液转移至另一个无菌试管中，振荡混匀。用0.85%无菌氯化钠溶液稀释至108CFU/mL的工作细菌悬液，并用加入适量的无菌甘油，使甘油的最终浓度为40%，2℃～8℃保存，24h可用。

1.2.3染菌载体制备

取加入甘油的试验菌悬液将经灭菌的载体片（1cm×1cm、经脱脂处理）逐片进行滴加染菌。菌液滴加量每片为10uL，并用接种棒涂匀整个载体表面。染菌后可将染菌载体置于37℃温箱内干燥20min或室温下自然阴干。将染菌载体放入相应低温环境至少30min，确保指示微生物达到相应低温后，方可进行载体喷雾试验，且每个菌片的回收菌数应为5×105CFU/片-5×106CFU/片。

1.2.4悬液定量杀灭试验

試验时，将加热制冷浴槽分别调节温度至-40℃、-20℃、4℃和20℃四个不同的温度，将消毒剂4mL和含有机干扰物的试验菌悬液1mL放入3个不同的低温下平衡5min后，将消毒剂和含有有机干扰物的试验菌悬液混合作用至规定时间，吸取混合液0.5mL加入至4.5mL经灭菌的中和剂中，混匀，作用10min后计数，培养。同时做阳性对照，试验重复3次。

1.2.5载体喷雾定量杀灭试验

试验时，将高低温试验箱分别调节温度至-40℃、-20℃、4℃和20℃四个不同的温度，将5片染菌载片各放置于无菌平皿内，分别放置于高低温试验箱不同部位，当消毒剂和染菌载片在相应温度下平衡30min后，用相应浓度的消毒剂（反应液）的电动喷雾器对上述染菌载片进行均匀喷雾。喷雾量以不使菌片湿透、流液为度。待试验菌和消毒剂作用至规定时间，取载片各移入5mL中和剂中，振荡混匀，洗脱菌片上的细菌至中和剂中，作用10min后计数，培养。同时做阳性对照，试验重复3次。

2 结果

2.1低温试验

消毒剂在低温环境下的低温试验见表1。

2.2染菌载片菌数回收结果

与标准方法的染菌载片相比，该研究对染菌载片的制作进行了配方优化，加入甘油，以防止冰晶对细胞造成伤害。将按标准方法制作的染菌载片与优化后的染菌载片进行载体菌落回收，结果表明优化后用于低温条件下杀灭试验的染菌载片的菌落回收数能达到5×105CFU/片～5×106CFU/片之间，回收数明显高于未优化的染菌载片。回收菌数的结果见表2。

2.3悬液定量杀灭试验结果

结果表明，在-40℃、-20℃、4℃、20℃温度下，消毒剂C、D、E和F对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭对数值均>5.00;消毒剂B因在-40℃结冰因素影响无法进行杀灭试验，其他三个温度下，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭对数值均>5.00;消毒剂A是常温下使用的消毒剂，故在-40℃和-20℃结冰因素影响无法进行杀灭试验，20℃时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭对数值均>5.00。试验结果见表3。

2.4载体喷雾定量杀灭试验结果

结果表明，在-40℃、-20℃、4℃、20℃温度下，消毒剂C、D、E和F对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭对数值均>3.00;消毒剂B因在-40℃结冰因素影响无法进行杀灭试验，其他三个温度下，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭对数值均>3.00;消毒剂A是常温下使用的消毒剂，故在-40℃和-20℃结冰因素影响无法进行杀灭试验，20℃时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭对数值均>3.00。试验结果见表3。

2.5温度对消毒剂杀菌效果的影响。

从表3、表4可以看出，与作用温度为20℃时的杀灭效果相比较，作用温度为4℃时对消毒剂A作用10min的杀灭效果有中度影响;作用温度为-20℃和-40℃时对消毒剂A作用10min的杀灭效果有重度影响;作用温度-40℃时对消毒剂B作用10min的杀灭效果有重度影响;作用温度-40℃、-20℃和4℃时对消毒剂C、D、E和F作用10min的杀灭效果无影响。

3 讨论

细菌的组成成分和人类似，都是有水、糖、蛋白质、核苷酸和脂质（构成细胞膜）组成[6];病毒则主要是由蛋白质和核苷酸构成，所以只要消毒剂能破坏掉蛋白质或核苷酸的生理活性，就可以认为它能够同时消灭细菌与病毒。新出现的新冠病毒对外界的抵抗力不强，对紫外敏感，一般56℃ 30min的条件下就能杀死它，都能被75%乙醇、过氧化物类和含氯消毒剂等消毒剂有效地灭活[7]。消毒技术规范1.4.4.3规定了微生物对消毒因子的敏感性，代表有脂質膜的亲脂病毒是最容易被消毒剂所杀灭，而新冠病毒就是含有脂质膜的亲脂病毒的一种，对消毒因子的敏感性最高，是比细菌繁殖体更容易被消毒剂所杀灭，所以选择抵抗力较新型冠状病毒高的金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）和大肠杆菌（8099）作为指示微生物[5]。

目前低温消毒剂已有几款研制成功，通过了低温试验，低温状态下的杀菌效果试验也有若干报道[8-9]，但都未对菌悬液和染菌载体进行讨论。杀灭试验都需在试验前对菌悬液和染菌载体进行相应温度的平衡，如不进行优化则会在低温环境下结冰无法进行试验和影响载体的菌数回收。甘油作为防冻剂能有效防止液体冰晶对细胞造成伤害，能有效降低冰点，但甘油浓度过低在低温杀灭试验时易结冰，使菌死亡，浓度过高也会使菌脱水导致死亡，故该试验最终确立的甘油浓度为40%。

常规消毒方式对环境温度条件都有明确的要求，均在常温条件下进行。由于这些消毒剂均是以水作为溶剂，在低温冷冻条件下，液体消毒剂冷凝成为固态，难以发挥消毒作用，故在低温环境下进行的消毒还需考虑如何降低消毒剂的冰点及保证在低温条件下的消毒效果等[9]。

4 结论

该研究选定的消毒剂经低温试验后可用于消毒剂的杀灭试验，经验证，常规的消毒剂如消毒剂A温度对消毒剂的杀灭效果影响较大，消毒剂C和F因本身冰点低，温度对消毒剂的杀灭效果无影响，消毒剂B、D和E在加了相应的防冻剂后能用于低温环境下的消毒。

该研究结论表明，低温消毒剂经低温试验验证后，试验温度为在-40℃、-20℃、4℃、20℃温度下，常温消毒剂低温试验结冰无法进行杀灭试验;未优化的菌悬液低温下平衡会结冰影响试验结果，染菌载体菌落回收数明显降低;在配方优化后，低温消毒剂在相应低温下用悬液定量法作用10min后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭对数值均>5.00;载体喷雾定量法作用10min后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭对数值均>3.00。该方法的研究建立适用于新冠疫情下低温冷链低温消毒剂的杀灭试验，能为其他实验室的低温模拟杀灭试验提供一定的参考价值。

参考文献

[1] 刘希真.三种消毒剂在低温下对染菌表面消毒效果的比较[J].消毒与灭菌，1985（3）：141-142.

[2] 徐莉，王连鸳，李建，等.低温环境下某含氯消毒剂对微生物消毒效果影响初步研究[C]// 中国化学会第30届学术年会摘要集-第三十四分会：公共安全化学.中国化学会，2016.

[3] 张英涛， 刘占， 马宁宁，等. 低温状态下常用消毒剂消毒效果评价[J]. 河南畜牧兽医：综合版， 2019， 40（12）：8-10.

[4] 姜秀梅，张玲平，高淑芹，等.低温条件下邻苯二甲醛对分枝杆菌杀灭效果的研究[J].中国消毒学杂志，2018，35（10）：744-745，748.

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[6] 陈华，王莹.细菌生物膜形成过程成分及结构的研究进展[J].黑龙江科学，2020，11（4）：38-39，42.

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[9] 陈路瑶，章灿明，黄育红，等.常用消毒剂低温消毒效果观察[J].中国消毒学杂志，2021，38（4）：245-247.

作者简介：黄甜甜（1994—），女，本科，助理工程师，研究方向为微生物检测。

DOI：10.16661/j.cnki.1672-3791.2201-5042-1177