玉米须多糖对高盐诱导高血压大鼠的抗血管氧化应激作用

梁衍锋 尤清欣 谷青芸 王景涛 舒涛 王凤月 张嘉倪 宋红瑞 王浩然 张东东

(佳木斯大学 1基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007；2临床医学院)

高血压患病率呈逐年上升趋势。中国每年由于血压升高而导致过早死亡的人数高达200万，每年直接医疗费用达366亿元人民币，是当今世界重大的公共卫生问题〔1〕。中国膳食构成以高钠、低钾为主，而人体钠盐的摄入量与高血压患病率和机体血压水平呈正相关〔2〕，这成为中国高血压患者发病的重要危险因素。然而，高血压发病机制的复杂性使其临床治疗效果却不尽如人意。研究表明，机体中氧化应激是影响高血压发生发展的重要机制〔3，4〕。有报道显示，自发性高血压大鼠(SHR)血浆活性氧簇(ROS)、丙二醛(MDA)等氧化应激指标明显增高，而抗氧化物质超氧化物歧化酶(SOD)水平明显降低〔5〕，说明降低高血压患者体内氧化应激水平对高血压的防治至关重要。玉米须是禾本科作物玉米的干燥花柱和柱头，美国食品药品管理局已确认其为无毒、安全的物质。玉米须提取物中含有多种化学成分，包括糖类、黄酮类、甾醇类、氨基酸、烷和无机元素等。玉米须多糖(PCS)是自玉米须中提取的水溶性提取物，含量达4%，具有明显的抗氧化、降血糖、利尿、抑制肿瘤等作用〔6～8〕。本实验通过给予高盐诱导的高血压大鼠强饲PCS进行干预，研究PCS抗氧化应激作用对其血压的影响，并探讨其降压机制。

1 材料和方法

1.1仪器及试剂 BP-100 无创血压测量系统、BL-420E生物机能实验系统(四川成都泰盟)；细胞超声波破碎仪(美国Thermo Scientific公司)；高速冷冻离心机(美国Eppendorf公司)；PowerPC电泳仪、Trans-Blot转移电泳槽(美国Bio-Rad公司)；752 型紫外分光光度计(上海光学仪器厂)等。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)2、NOX4抗体(英国Abcam公司)；marker(美国Thermo Scientific公司)；活体组织氧化应激ROS初级荧光测定试剂盒(美国Genmed公司)；MDA、SOD测试盒(南京建成生物工程公司)；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶配制试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore公司)。

1.2实验设计 Dahl盐敏感雄性大鼠40只，适应性喂养1 w，随机分为正常饮食+生理盐水(NS+vehicle)组、正常饮食+PCS(NS+PCS)组、高盐饮食+生理盐水(HS+vehicle)组、高盐饮食+PCS(HS+PCS)组各10只。高盐饮食中含8% NaCl，正常饮食中含0.3% NaCl，4 w后测量大鼠平均动脉压(MAP)，MAP达到120 mmHg以上视为模型建立成功；HS+PCS组在模型制备成功后强饲PCS(400 mg/kg)20 d，其余组强饲等体积生理盐水。

1.3PCS提取 采集佳木斯地区成熟期的玉米须制备成干燥品，剪碎后利用水溶醇沉法提取PCS。利用D101大孔树脂对粗提物进行脱色，氯仿正丁醇(Sevage)法去除蛋白成分，再经无水乙醇、95%乙醇、丙酮、乙醚多次进行洗涤清除杂质，使用透析袋进行透析，干燥，用时采用生理盐水现配现用。粗提率为3.21%。

1.4平均动脉压(MAP)测量及主动脉采集 利用BP-100尾动脉血压测量仪测量清醒状态下的大鼠的MAP，MAP=(收缩压+2×舒张压)/3。将清醒大鼠放入固定器，依次将阻断器与传感器套于大鼠的尾部，待大鼠平静后测量血压，取8次测量平均值。所有药物干预结束后，采用BL-420E生物机能实验系统经颈动脉插管测量大鼠MAP，结束后迅速采集胸主动脉，一部分马上进行ROS水平检测，另一部分-80℃冰箱保存备用。

1.5蛋白提取及定量 低温状态下取胸主动脉研碎，洗涤，离心弃上清。加入冷存的50×蛋白酶抑制剂20 μl及蛋白裂解液1 ml，冰浴条件下放入细胞超声破碎仪破碎，4℃下离心，13 000 r/min，15 min。取上清，使用二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白质定量检测，-80℃冰箱保存备用。

1.6Western印迹检测 按照凝胶配制试剂盒使用说明制备凝胶，将配好的凝胶按要求注入胶板空隙内，插梳，备用。取出低温保存的marker、样品，使用微量上样器将marker、样品依次加入对应的泳道。低温状态下电泳使蛋白分离。切胶，将厚滤纸、凝胶、PVDF膜、厚滤纸依次叠在一起，盖好盖板。接通电源，低电压条件下转膜。室温封闭后，加入稀释的一抗(NOX2、NOX4)，冰箱孵育过夜。取出过夜膜室温下复温，TBST洗涤，10 min/次，3次。加入相应二抗，室温下置于摇床孵育 1 h。 TBST 洗涤，10 min/次，3次。将洗涤好的膜置于化学发光成像仪内，加电化学发光(ECL)液成像，拍照采集。对采集的图像使用Quantity One软件进行分析。

1.7主动脉ROS水平测定 取新鲜胸主动脉，按照活体组织氧化应激ROS初级荧光测定试剂盒说明操作，低温下清理液清理后无菌滤纸吸干切碎，稀释液充分混合匀浆，与染色工作液放入石英比色杯，激发波长490 nm，散发波长520 nm，荧光分光光度仪检测。

1.8血浆MDA水平及SOD活力检测 实验结束后各组大鼠禁食12 h，采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉，颈动脉插管测量血压后取血，2 000 r/min离心分离血浆。按照试剂盒的说明分别采用硫代巴比妥酸(TBA)法和水溶性四唑蓝(WST)-1法检测血浆MDA水平和SOD活力。

1.9统计学处理 采用SPSS17.0 软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组不同给药时间MAP变化比较 与NS+vehicle组相比，NS+PCS组无明显差异(P>0.05)，HS+vehicle组和HS+PCS组MAP明显增高(P<0.05)；与HS+vehicle组相比，HS+PCS组MAP从给药第9天开始MAP明显降低，到第20天时MAP最低(P<0.05)，见表1。

表1 各组不同给药时间MAP比较

2.2各组主动脉NOX2、NOX4表达、ROS、MDA水平及SOD活力比较 与NS+vehicle组相比，NS+PCS组各指标无明显差异(P>0.05)；HS+vehicle组和HS+PCS组主动脉NOX2、NOX4蛋白表达、ROS及MDA水平明显增高，而SOD活力明显降低(均P<0.05)；与HS+vehicle组相比，HS+PCS组主动脉NOX2、NOX4蛋白表达、ROS及MDA水平明显降低，而SOD活力明显增高(均P<0.05)，见图1、表2。

图1 各组主动脉NOX2、NOX4表达

表2 各组主动脉NOX2、NOX4、ROS及血浆MDA、SOD水平比较

3 讨 论

高血压作为多基因遗传病，其发生发展受到环境和生活习惯等多种因素的影响。钠盐的过度摄入与高血压发病密切相关。本研究结果进一步证明了高盐饮食是促进高血压发生的重要因素。目前对于PCS研究主要集中于其抗氧化、抗感染、降血糖和抑制肿瘤等作用〔6～8〕，其对于高血压的影响及机制的研究尚需要更多的理论依据。本研究结果说明PCS对高盐诱导的高血压具有明显的降压效果，但其对于正常血压者并未发生明显影响，可见其治疗高血压具有安全性。这与一项研究中提出的PCS能明显降低血压的结果相一致〔9〕。

氧化应激是氧自由基产生和消除失衡导致体内ROS过量蓄积的过程，其与多种疾病的发生发展密切相关。ROS在血管内主要由NOX催化产生。人类NOX基因组包括NOX1、NOX2(即gp91phox)、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox2共7个成员。其中NOX2和NOX4作为NADPH氧化酶的2个重要亚型，其在血管内ROS的形成中至关重要〔10〕。SOD是体内重要的抗氧化酶，可通过催化超氧阴离子发生歧化反应而减少氧自由基对机体的损伤〔11〕。本研究结果说明主动脉中NADPH氧化酶介导的ROS增加可能是促进高血压发生发展的重要机制。体内蓄积的氧自由基能攻击生物膜的多不饱和脂肪酸，从而引发脂质过氧化，并形成脂质过氧化物，如MDA。而SOD作为抗氧化酶是机体清除自由基的首要物质，因此SOD活力测定常与MDA水平测定相互配合进行，来反映机体清除氧自由基的能力和受自由基攻击的严重程度〔12〕。本研究结果说明高血压时机体抗氧化能力下降，血管中自由基引起的脂质过氧化与高血压密切相关。上述实验结果均说明血管氧化应激反应是高盐诱导的高血压的重要发病机制。

PCS具有明显的抗氧化作用。研究表明，水提醇沉法制备的PCS清除超氧阴离子和羟基自由效果显著〔7〕。本研究结果说明PCS可明显有效抑制高血压时血管ROS合成酶NOX2 和NOX4的表达，降低血管ROS水平，抑制脂质过氧化反应，同时增强血管抗氧化能力，从而改善高盐诱导的高血压。研究报道，高血压时ROS水平失衡能促进外周血管收缩，从而引起血压进一步升高〔13～15〕。结合PCS在本研究中对于高盐诱导的高血压的降压作用，提示PCS可能通过降低血管氧化应激反应、增强抗氧化能力，并进而影响血管舒缩功能，达到降低高盐诱导的高血压的作用。