汉黄芩苷对溃疡性结肠炎大鼠促炎因子、氧化应激标志物水平的影响及黏膜修复作用

张霞 杜文泽 赵汉清 张硕

(河北北方学院附属第二医院 1消化内科 河北 张家口 075100；2超声科；3中医科；4手术室)

溃疡性结肠炎(UC)病变主要局限于结肠黏膜及黏膜下层，多累及乙状结肠、直肠，严重者可危及整个结肠，其病因复杂，涉及多种饮食、感染、环境等因素〔1，2〕。UC临床上一般表现为腹泻、腹痛、黏液性脓血便、里急后重，病理以结肠溃疡糜烂为主，伴有连续性、浅表性、弥散性特点，病程长，且易复发〔3，4〕。目前临床上治疗UC多采用生物制剂、免疫抑制剂、氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、抗生素等，疗效不佳，副作用多，且复发率高，严重影响患者生活质量〔5〕。汉黄芩苷是黄芩的主要成分之一，具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗氧化等药理作用〔6，7〕。目前尚未有汉黄芩苷治疗UC的相关报道，本研究构建UC大鼠模型，考察不同剂量汉黄芩苷对UC大鼠症状缓解情况及对炎症因子、氧化标志物水平的影响。

1 材料与方法

1.1试剂和仪器 汉黄芩苷(货号：B20488，规格20 mg，纯度≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司；柳氮磺胺吡啶(SASP)肠溶片(国药准字H31020450，批号：20190106)购自上海中西三维药业有限公司；过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，货号分别为A007-1-1、A005-1-2、A044-1-1、A001-1、A003-1；白细胞介素(IL)-1β、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，货号分别为E-EL-R0012c、E-EL-R0016c、E-EL-R0019c；XSP-9CA型生物显微镜购自上海光学仪器厂。

1.2实验动物及模型制备 雄性Wistar大鼠(SPF级)购自广州中医药大学实验动物中心，7周龄，体重220～250 g，许可证号：SYXK(粤)2018-0001。适应性饲养1 w后根据Morris等〔8〕方法建立UC大鼠模型：建模前均禁食禁水1 d，以4 mg/100 g剂量腹腔注射2%戊巴比妥钠以麻醉大鼠，用14号导尿管(直径2 mm、长15 cm)一次性将2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS,100 mg/kg)和0.25 ml乙醇溶液缓缓注入距大鼠肛门约8 cm深的肠腔内，注入完成后捏紧肛门，并倒置5 min，术后常规饲养。实验分为对照组(该组大鼠采用同样方法注入等体积的生理盐水)；将UC模型大鼠分为UC模型组；SASP组(0.67 g/kg)〔9〕；低剂量汉黄芩苷(25 mg/kg)组；中剂量汉黄芩苷(50 mg/kg)组；高剂量汉黄芩苷(100 mg/kg)组〔10〕，每组10只。造模后第2天开始以2 ml给药体积灌胃给药，对照组灌胃等体积生理盐水，1次/d，连续给药7 d。

1.3各组大鼠一般情况 治疗期间观察各组状态及大便情况，根据疾病活动指数(DAI)评分，评分标准参照Arab等〔11〕所描述的标准进行，详细标准如下：0分：体重减少<1%：大便正常，潜血阴性；1分，体重减少≥1%且<5%；2分：体重减少≥5%且<10%，出现软便，且潜血阳性；3分：体重减少≥10%且<15%；4分：体重减少≥15%，出现溏便和肉眼可见的血便。

1.4样本采集和保存 最后一次给药24 h后，脱颈处死各组大鼠，沿腹部刨开，取出距肛门约8 cm处结肠，采用双盲法肉眼观察各组大鼠结肠病理损伤情况，记录并参照Galvez等〔12〕所描述的标准进行评分，评分标准：无损伤0分；充血但无溃疡1分；1处线性溃疡但是无明显炎性反应2分；1处线性溃疡和炎性反应3分；2处或多处溃疡或炎性反应，直径<1 cm 4分；2处或以上溃疡及炎性反应，直径>1 cm 5分。将结肠组织置于10%多聚甲醛固定，剩余结肠组织储存于-80℃冰箱中待后续检测。

1.5各组大鼠促炎因子、氧化应激标志物检测 从-80℃冰箱中取出结肠组织，加入适量缓冲液，4℃条件下匀浆，随后离心取上清液进行测定。酶联免疫吸附试验(ELISA)测定结肠组织中IL-1β、IL-10、TNF-α水平；生化法检测结肠组织中CAT、GSH-Px、MPO、SOD、MDA水平，操作步骤均按照试剂盒说明书执行。

1.6各组大鼠结肠组织苏木素-伊红(HE)染色 将固定好的各组大鼠结肠组织取出，置于生物脱水机行逐级脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，连续切片(厚度约4 μm)，行常规HE染色，封片后用光镜观察各组结肠组织病理变化。

1.7统计学方法 采用SPSS22.0软件进行方差分析，两组比较行SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况比较 大鼠造模24 h后可见黏液性稀便，部分可见便血，毛发无光泽、精神萎靡、饮食减少、懒动，说明UC模型大鼠构建成功。经治疗后，低、中剂量汉黄芩苷组大鼠稀便及血便症状稍缓解，毛色略显晦暗无光泽；高剂量汉黄芩苷组和SASP组稀便及血便症状明显缓解，毛色恢复光亮。与对照组〔(0.00±0.00)分〕相比，UC模型组DAI评分显著升高〔(9.41±0.92)分，P<0.05〕；经汉黄芩苷治疗后，随着给药剂量增高，DAI评分依次降低〔(8.95±0.89)分、(7.93±0.82)分、(5.53±0.54)分，P<0.05〕；高剂量汉黄芩苷组DAI评分与SASP组〔(5.86±0.71)分〕差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2各组结肠组织宏观损伤情况比较 肉眼可见UC模型组大鼠结肠溃疡表浅多且大，黏膜严重糜烂；经治疗后，结肠溃疡数量、面积减少，程度减轻，黏膜损伤情况有所缓解，且症状改善程度与汉黄芩苷剂量呈正相关。与对照组〔(0.00±0.00)分〕相比，UC模型组宏观损伤评分显著升高〔(4.52±0.61)分，P<0.05〕；经汉黄芩苷治疗后，随着给药剂量增高，宏观损伤评分依次明显降低〔(4.02±0.44)分、(3.36±0.52)分、(2.51±0.27)分，P<0.05〕；高剂量汉黄芩苷组宏观损伤评分与SASP组〔(2.72±0.34)分〕差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3各组结肠组织中IL-1β、IL-10、TNF-α、CAT、GSH-Px、MPO、SOD、MDA水平比较 与对照组相比，UC模型组、SASP组、汉黄芩苷各剂量组IL-1β、TNF-α、MPO、MDA水平显著升高，IL-10、CAT、GSH-Px、SOD水平明显降低(P<0.05)；经汉黄芩苷治疗后，随着给药剂量增高，IL-1β、TNF-α、MPO、MDA水平依次明显降低(P<0.05)，IL-10、CAT、GSH-Px、SOD水平依次明显升高(P<0.05)；高剂量汉黄芩苷组IL-1β、IL-10、TNF-α、CAT、GSH-Px、MPO、SOD、MDA水平与SASP组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组结肠组织中IL-1β、IL-10、TNF-α、CAT、GSH-Px、MPO、SOD、MDA水平比较

2.4各组结肠组织HE染色结果比较 对照组结肠黏膜完整，未见炎症损伤，肌层排列整齐，腺体结构正常，未见充血；UC模型组结肠黏膜均有明显炎症损伤、变薄，大量炎性细胞浸润，肌层结构紊乱，腺体充血、水肿；经汉黄芩苷治疗后，随着给药剂量增高，结肠黏膜、肌层、腺体病变损伤明显缓解；高剂量汉黄芩苷组症状缓解情况与SASP组相当。见图1。

图1 各组结肠组织HE染色(×200)

3 讨 论

UC在中医学上属于“休息痢”“泄泻”“痢疾”等范畴，该病机以血热妄行、湿热蕴结大肠为主〔5〕。目前多认为促炎因子和抑炎因子、氧化介质和抗氧化介质之间的平衡紊乱是其主要病因，而汉黄芩苷具有抗炎、抗氧化的药理作用。

研究发现，汉黄芩苷能够抑制Toll样受体(TLR)4介导的核转录因子(NF)-κB炎症信号通路活性，从而发挥抗炎作用，以缓解LPS诱导的急性肺损伤症状〔13〕。此外汉黄芩苷可抑制NOD样受体蛋白3炎症小体(NLRP3)和NF-κB活化以发挥抗炎作用，缓解3，3′-二甲氧基联苯胺盐酸盐(DSS)诱导的结肠炎症状〔14〕。叶圣荣等〔15〕研究发现汉黄芩苷能够下调MDA水平，上调SOD、还原性谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮合酶(iNOS)水平以抑制肾缺血/再灌注损伤大鼠氧化应激反应，保护肾功能。本研究说明汉黄芩苷能够缓解UC症状，对UC有一定的治疗效果。行结肠组织宏观损伤分析发现，UC模型组大鼠结肠溃疡表浅多且大，黏膜严重糜烂；经汉黄芩苷治疗后，结肠溃疡数量、面积减少，程度减轻，黏膜损伤情况有所缓解，随着给药剂量增高，宏观损伤评分依次降低，说明汉黄芩苷能够保护UC大鼠结肠组织，促进黏膜修复。病理学HE染色结果同样说明，经汉黄芩苷治疗后，随着给药剂量增高，结肠黏膜、肌层、腺体病变损伤明显缓解。炎症因子异常表达与UC相关，UC活动期大量单核-巨噬细胞聚集于结肠黏膜，合成并释放大量IL-1β，引起结肠黏膜炎症反应，从而导致黏膜组织破坏〔16〕。IL-10作为抑炎因子，可抑制单核细胞和巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子，维持正常肠道黏膜免疫调节〔17〕。TNF-α主要表达在淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的胞质中，能够使中性粒细胞聚集、发生呼吸爆发、脱颗粒等参与UC病程〔18〕。本研究结果说明，汉黄芩苷能够下调促炎因子IL-1β、TNF-α水平，上调抑炎因子IL-10水平以抑制UC大鼠炎症反应。SOD可清除机体超氧化物阴离子，具有抗氧化作用，当其含量降低时，导致自由基累积，MDA作为质子过氧化物最终产物能够间接反映氧化应激程度，因此测定SOD、MDA水平可反映机体氧化应激程度〔19〕。CAT位于细胞的过氧化体中，作为抗氧化系统中酶系统的重要组成部分，能够与SOD协同清除自由基，保护机体免受损害，可作为评价机体的抗氧化能力〔20〕。GSH-Px作为过氧化氢酶，在机体中分布广泛，可保护细胞膜功能和结构免受过氧化氢的氧化损伤〔21〕。MPO是由中性粒细胞产生的过氧化物酶，一般分布在单核细胞和嗜中性粒细胞中，其水平可反映中性粒细胞浸润程度〔22〕。本研究说明汉黄芩苷可调节氧化因子和抗氧化因子平衡，拮抗氧化应激进程。