IQGAP3在结直肠癌组织中的表达及其与临床预后的关系

杨会举 卢玉阳 李敏 刘俊红 崔世超 周晓丽 姜亚欣 刘佃温

(河南中医药大学第三附属医院肛肠科，河南 郑州 450008)

随着研究的不断深入，结直肠癌(CRC)的早期监测和治疗已经有了显著的改善，但不幸的是，CRC仍然是全世界男性和女性癌症相关死亡的第四大原因〔1〕。据统计，目前每年有超过7 000例男性和60 000例女性被诊断为CRC，并且有超过26 000例男性和24 000例妇女死于这种疾病〔2〕。下一代测序技术的普及，让我们对于包括遗传变异和表观调控变化在内的分子改变有了更深的理解〔3〕，但对于CRC整个发展过程中的具体分子机制的认识仍然有限，这也对于疾病的早期诊断和治疗提出了挑战，需要进一步研究以更全面地了解CRC的发病机制。

基于前期的研究〔4～7〕发现，含三磷酸鸟苷水解酶激活蛋白的IQ基序(IQGAP)家族与癌细胞的突变和疾病的进展密切相关。IQGAP家族由3个成员组成：IQGAP1、IQGAP2和IQGAP3。IQGAP3是其中最新发现的蛋白，可以通过与靶蛋白相互作用，在正常细胞〔8,9〕和癌细胞的增殖〔4～7〕及癌细胞的迁移和侵袭性的调控中发挥作用。然而，目前尚无研究报道IQGAP3在CRC中的表达情况及对于CRC的诊断和预后中的作用。因此，本研究通过收集CRC组织和相关细胞系，探究IQGAP3在组织和细胞系中的表达和对于癌细胞迁移和增殖的影响，并在临床实际中探究其对于CRC患者的诊断预测作用及对于CRC治疗靶点的启发作用。

1 资料与方法

1.1组织样本和临床指标 结肠癌组织及配对正常邻近组织(阳性对照组)样本取自河南中医药大学第三附属医院接受手术的病人，肿瘤和正常组织均进行组织病理学分析和诊断确认，从2012年1月至2014年12月，共纳入157例患者，69.2(57.2～73.2)岁。以免疫组化(IHC)H评分140分为IQGAP3高、低表达的临界值，分为高表达组(91例)和低表达组(66例)。手术取出组织后，立即在液氮中冷冻组织样本，并在-80℃低温冰箱中储存。本研究中使用患者样本的方案均获得河南中医药大学第三附属医院伦理委员会的批准患者均签署相关知情同意书。同时收集患者术前人口学特征、肿瘤标志物情况、术后的肿瘤分期及肿瘤本身的特征性指标。以手术时为随访起点，术后前半年每月复查，半年后每3个月复查，记录患者复发时间，随访的终点为复发或随访满5年。

1.2RT-PCR 总RNA的提取采用Trizol试剂(Thermo Fisher Scientific，美国)，其数量和质量由NanoDrop2000分光光度计(Thermo Scientific，美国)测定，然后用逆转录酶试剂盒(Funeng)将RNA逆转录成cDNA。PCR的参数如下：95℃持续3 min，40个95℃循环10 s，58℃ 30 s。数据标准化采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)表示，引物序列如下：IQGAP3正向引物：5′-ACTGGCTTACATTCGTCACA-C-3′，反向引物：5′-GTTCTTTTTGTCTAGATGTCGTG-3′；GAPDH正向引物：5′-GGGACCAAAGGGTCAT-3′，GAPDH反向引物：5′-GAGTCCTTCCATACCAA-3′。所有RT-qPCR数据先表示为阈值周期(显示为ΔCT)值，然后将其转换为倍数变化。

1.3免疫组化 使用标准链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法对IQGAP3进行IHC分析。为了提取抗原，石蜡组织切片经微波处理2 h，并在0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中煮沸18 min，然后用0.5%Triton处理20 min以打破细胞膜。将载玻片与抗人IQGAP3的小鼠单克隆抗体(Milipore，1∶200稀释度)在4℃下孵育过夜，然后与抗鼠IgG抗体孵育2 h。阴性对照玻片在相同条件下用山羊血清和次级抗体检测。两位病理医生独立检查染色切片。根据Chen等〔10〕描述的H评分法评估IQGAP3免疫染色密度。H评分=染色弱的肿瘤细胞%+染色中等的肿瘤细胞%×2+染色强的肿瘤细胞%×3，H评分范围从0(100%阴性肿瘤细胞)到300分(100%强染色肿瘤细胞)。每个组织样本根据H评分进行半定量评分。两位病理学家的结果取平均值并用于统计分析。

1.4Western印迹法 用洗涤剂裂解缓冲液(碧云天，上海)制备总细胞裂解液。总蛋白浓度由Bradford测定法(Bio-Rad，美国)测定。等量的蛋白质(每道20 μg)在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离，转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(Bio-Rad,美国)。将膜在室温下用5%脱脂牛奶阻滞1 h，然后用抗IQGAP3和抗GAPDH(1∶1 000稀释，Biotechnology，美国)初级抗体在4℃下孵育过夜，洗涤后，用辣根过氧化物酶(HRP)结合的抗小鼠或抗兔抗体(Biotechnology，美国)在室温下孵育2 h，用化学发光检测系统(Thermo Scientific，美国)观察蛋白带。每个印迹重复3次，蛋白质条带的强度在归一化为相应的蛋白质对照后，用密度计进行分析。

1.5细胞增殖和迁移实验 人CRC细胞系HT-29购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所(上海)。细胞在DMEM培养基中培养，培养基中补充有10%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素，在37℃、5%CO2的加湿空气中培养。将细胞充分混匀后铺到12孔板中，每4个孔为一组，分为3组，分别为空白组，IQGAP3 siRNA干扰组和对照siRNA组。每个孔内播种3.0×105细胞，IQGAP3 siRNA干扰组和对照siRNA组的孔，加入室温温育后的100 pmol siRNA和Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen，上海)混合液，在37℃的二氧化碳培养箱中培养，48 h后收获做进一步研究。

将100 μl完整的RPMI1640培养基包括5×103个HT-29细胞转移在96孔板中，培养24和48 h，每孔中加入10 μl细胞计数CCK-8溶液(Dojindo，上海)，37℃培养1.5 h，使用ELX-800光谱仪阅读器(Bio-Tek，美国)在450 nm处测量吸光度。迁移试验在含有8 μm孔膜的24孔Chemotaxis室中进行。将细胞加入上层室(2×104个细胞/孔)，并向下层室加入0.5 ml RPMI1640和20%FBS。孵育24 h后取出上室的细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗膜3次，用结晶紫染色。迁移程度以每室五场中细胞的平均数表示。

1.6统计学分析 采用SPSS23.0(IBM，美国)进行χ2检验和线性回归。生存率采用Kaplan-Meier法评价，生存曲线间的差异用Log-rank检验，并采用Cox比例风险模型进行单因素和多因素分析。使t检验或Mann-Whitney检验进行两组组间比较。

2 结 果

2.1IQGAP3在CRC组织和临近正常组织中的表达 IQGAP3 mRNA在癌组织中的表达(0.004 2±0.002 3)显著较正常组织高(0.001 0±0.000 6，P<0.001)，应用IHC的H评分比较癌组织和正常邻近组织中IQGAP3蛋白表达水平发现，癌组织中IQGAP3蛋白表达也显著提高(113.9±64.7 vs 12.2±8.4，P<0.001)。

2.2IQGAP3表达和临床特征之间的相关性 157例患者癌胚抗原(CEA)12.5(8.9～16.9)μg/L，CA125 54.5(37.7～65.2)U/ml，CA199 57.8(36.3～66.1)U/ml。高表达组和低表达组CEA、CA125、CA199水平及淋巴结转移情况有显著差异(P<0.05)，但两组病理分级、肿瘤直径和TNM分级没有显著差异(P>0.05)。见表1。IQGAP3的表达水平与CEA水平(r=0.67，P<0.05)、CA125水平(r=0.53，P<0.05)和CA199水平都有显著的线性相关关系(r=0.65,P<0.05)。见图1。

表1 IQGAP3表达与临床、病理特征的相关性〔M(Q1～Q3)〕

图1 IQGAP3的H评分和肿瘤标志物CEA、CA125、CA199的线性相关性

2.3IQGAP3表达与预后的关系及预后的危险因素分析 高表达组、低表达组及阴性对照典型IHC表现见图2。高表达组(37.0%)和低表达组总生存率(60.0%)具有显著差异(P=0.024)。见图3。

图2 CRC组织中IQGAP3高表达、低表达和 阴性对照典型IHC(×400)

图3 高、低表达组生存曲线

单因素和多因素分析的结果见表2。单因素Cox回归分析显示，高CEA水平、高CA199水平、TNM分期、淋巴结转移和IQGAP3高表达与CRC的总生存率有关(P<0.05)。采用多因素Cox回归分析显示，高CEA水平、TNM分期Ⅳ期、淋巴结转移和IQGAP3表达是总生存率的独立危险因素(P<0.05)。

2.4IQGAP3的表达对CRC细胞的增殖和迁移的作用 IQGAP3 siRNA干扰组IQGAP3表达及48、72 h细胞活力均显著低于空白组和对照siRNA组(P<0.05)。见表3、图4、图5。

表2 单因素和多因素COX生存分析

表3 各组IQGAP3及细胞活力比较

1～3：IQGAP3 siRNA干扰组，对照siRNA组，空白组图4 各组IQGAP3蛋白表达比较

图5 细胞迁移实验(结晶紫染色，×400)

3 讨 论

CRC是全球最主要的肿瘤之一，造成大量的医疗资源的占用，并且其发病率和死亡率在过去的几十年里持续增加〔11〕。

IQGAP家族是近期发现的人类蛋白家族，IQGAP家族的3个基因与癌症密切相关。虽然3者有很多同源片段，但3者在肿瘤中发挥的作用却有很大差别。IQGAP1主要作为原癌基因发挥作用，其激活与癌细胞的产生相关〔12,13〕，而 IQGAP2却显示出抗肿瘤的活性〔14～16〕。IQGAP3在肿瘤发生的多个阶段和各种癌症的发展中都有一定的作用。Zeke等〔17〕研究发现，IQGAP3是一种多功能支架蛋白，其发挥作用的机制在于通过与多种蛋白质的相互作用参与细胞黏附和细胞迁移。具体在肺癌中，IQGAP3可以通过与细胞外调节蛋白激酶(ERK)1的相互作用，促进表皮细胞生长因子(EGF)诱导ERK的激活，加速肺癌细胞的迁移和侵袭〔6〕。皮肤癌中，Monteleon等〔18〕发现IQGAP1和IQGAP3的高表达都对侵袭性表皮鳞状细胞癌的发生发展至关重要。而在肝癌中，Shi等〔19〕发现IQGAP3可以促进肝细胞癌的肿瘤转移和上皮-间充质转化。

本研究结果认为IQGAP3可能可以作为临床评估的标志物，IQGAP3的高表达与较高的TNM分期、较高的淋巴结转移率和较高血清学水平的肿瘤标志物相关，IQGAP3表达越高，患者的总生存率也更短；IQGAP3的表达可能参与了肿瘤的进展。IQGAP3对CRC有促进作用；IQGAP3除了是CRC的良好标志物外，也可能是CRC治疗的潜在靶点。

而关于IQGAP3促进恶性肿瘤进展的具体机制，目前也有一些相关的研究。除了Yang等〔6〕的报道，IQGAP3可以促进EGF受体(EGFR)-ERK信号转导和肺癌细胞的生长和转移之外，Xu等〔8〕的研究发现，IQGAP3可以通过下调细胞分裂周期蛋白(Cdc)42的表达而在胰腺癌细胞中发挥癌基因的作用；Shi等〔19〕的研究发现转化生长因子(TGF)-β信号转导激活从而诱导人肝细胞癌转移的必需途径即依赖于IQGAP3的诱导作用。以上所述的具体机制也可能是IQGAP3在CRC发生发展中的机制，然而本研究只是一个初步的临床关联性研究，在接下来的工作中，关于IQGAP3在CRC中的作用需要关注IQGAP3潜在的具体机制，并着重探索IQGAP3在肿瘤发生的各通路中上下游的调控机制。

不可否认的是本研究存在一定的不足。首先是回顾性的实验设计使得研究的进行是在储存的样本中进行新标志物的检测，有可能存在储存样本中蛋白的降解或检测的不准确的问题；其次本研究主要关注IQGAP3与临床指标的关系，缺乏进一步的机制研究。

综上所述，IQGAP3在CRC组织中显著高表达，并且与CRC相关的临床和病理指标高度相关，也可作为CRC的独立预后因子。今后的研究重点需要关注IQGAP3在CRC中的具体发生发展机制。